模式生物斑马鱼模型在方药研究中的应用＊

岳勤霏，刘 默，范欣生＊＊，余 黎

（1. 南京中医药大学中医学院·中西医结合学院 南京 210023；2. 南京中医药大学药学院 南京 210023）

斑马鱼又称蓝条鱼、花条鱼，原产于印度、孟加拉国等地，是一种常见的热带淡水鱼，体型小，成鱼体长4-6 cm，易饲养，繁殖能力强，四季产卵，产卵量大且为体外受精，体外发育[1]。斑马鱼模型与其他哺乳动物模型的生理、生化特征相似，与人类基因同源性达到87%[2]。其胚胎及幼苗早期光学透明，易于直观观察其特定生理病理变化，且便于实验操作，可用于观察药物对复杂生命过程的影响。作为整体实验动物模型，斑马鱼从整体水平评估药物的治疗效果及毒副作用，不仅筛选周期短，实验费用低，易于操作观察，且具有高效、快速、大规模的特点，是目前生命科学研究中重要的模式脊椎动物之一[1,3]。

斑马鱼模型应用于中医药研究，在毒理、活性成分筛选、药效评价和代谢研究等方面发挥着重要作用。中药或复方成分复杂，影响因素众多，限制了细胞筛选体系和分子筛选体系的应用，特别是在以有效部位、提取物甚至水煎剂为研究对象时则更加困难[4]。斑马鱼给药方式多样，可以通过皮肤和腮吸收小分子化合物，受精72小时的斑马鱼也可以通过吞咽吸收药物[1]，成鱼也可通过插管灌胃给药[3]，对于成分复杂的中药样品具有很好的适应性[5]，可用于中药及复方等复杂成分体系的药效评价及机制研究。基于以上优点，斑马鱼模型同样适用于方剂配伍规律研究。目前，斑马鱼疾病模型涉及广泛，包括血液疾病、心血管疾病、肌肉疾病、骨骼疾病、五官科疾病、传染病以及肿瘤等[6]，用于抗炎与抗氧化损伤、调节血管新生、抗骨质疏松以及抗神经损伤等方药的效应机制及配伍规律研究。

1 斑马鱼模型在方药研究中的应用

1.1 抗炎与抗氧化损伤方药研究

转基因、诱导突变和反义morpholino knockdown及活体成像等技术的应用，使得斑马鱼模型成为研究炎症免疫疾病相关的病理生理学的良好模式生物[4]，如Tg（coro1α:eGFP;lyz:Dsred）中性粒细胞与巨噬细胞双标志转基因斑马鱼[7]、巨噬细胞荧光转基因斑马鱼(zlyz:egfp)[8]等基因型斑马鱼的建立。斑马鱼炎症模型主要有细菌感染模型、病毒性感染模型、创伤性模型[7]以及硫酸铜溶液诱导模型。过氧化氢（H2O2）被广泛用作诱导细胞和斑马鱼氧化损伤的氧化剂，研究表明，斑马鱼是研究H2O2诱导的氧化应激的可用模型[9，10]。

Zhou J等以脂多糖（LPS）建立斑马鱼炎症模型，测量5 种炎症细胞因子和6 种靶向蛋白的基因表达并进行脂质组学分析以鉴定潜在的脂质标记物以阐明黄连解毒汤（HLJDD）全面的抗炎活性机制。结果表明，HLJDD 改善了大多数脂类摄动，具有很强的抗炎功效。Toll 样受体4/髓样分化因子88 TLR4/MyD88 的激活在炎症过程中起着至关重要的作用，而相应的脂蛋白（例如PLA2，SGMS 和SMDP）为脂质稳态与TLR4/MyD88 信号通路之间的重要中间体[11]。彭维兵等以硫酸铜溶液诱导巨噬细胞荧光转基因斑马鱼炎症模型，以斑马鱼侧线炎症病灶中巨噬细胞数量的影响评价昆海姜辛汤（褐藻多糖、昆布多糖、细辛脂素、姜辣素）及其组分配伍抗炎作用，结果表明昆海姜辛汤的合方组分配伍具有抗炎功效且寒热组分配伍较寒寒配伍及热热配伍效应明显[8]。杜婷婷等复制硫酸铜诱导中性粒细胞荧光斑马鱼炎症模型，冰乙酸、佛波酯诱导AB 系斑马鱼外周、中枢疼痛模型，定量评价如意珍宝丸（沉香、珍珠母、香旱芹、石灰华等）的抗炎镇痛疗效，结果表明如意珍宝丸具有显著的抗炎镇痛作用[12]。Li L 等利用硫酸铜溶液诱导斑马鱼炎症模型评价衢州枳壳提取物（QFAE）的抗炎活性，显示QFAE 能减少炎症部位的中性粒细胞数量，有明显的抗炎作用[13]。Ji M 等以H2O2诱导的氧化损伤斑马鱼研究发现菊苣酸可以减少活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的产生，激活抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）以及Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1/核因子E2 相关因子2/血红素加氧酶1（Keap1/Nrf2/HO-1）抗氧化途径，通过抗氧化而保护肝损伤[14]。

抗炎方药药效评价多应用转基因斑马鱼，以中性粒细胞、巨噬细胞定量为主。因斑马鱼幼鱼身体透明，可直接使用显微镜观察，此种方法较为直观可靠。同时，斑马鱼也可用于试剂盒检测，许多哺乳动物类实验动物氧化损伤相关指标，斑马鱼模型同样适用，例如ROS、MDA、SOD 等。炎症与氧化损伤是与许多人类疾病相关的复杂病理过程。许多疾病的发病机制与炎症、氧化损伤密切相关，例如呼吸系统疾病哮喘、慢性阻塞性肺疾病以及特发性肺纤维化等。斑马鱼作为重要的模式脊椎动物之一，已经建立了成熟的炎症以及氧化损伤模型，其应用对于深入研究方药抗炎抗氧化作用机制以及配伍作用规律具有重要意义。

1.2 调节血管新生方药研究

斑马鱼生长发育迅速，其心血管循环系统可在受精后48 小时完成发育，受精24 小时左右血液循环完成[15]。斑马鱼胚胎及幼体透明利于活体观察。目前，研究中常用造模方式为VEGF 受体抑制剂（VRI）诱导、PTK87 诱导以及移植瘤等，以节间血管（SIV）以及肠下血管（SIVs）的生长情况等为观测指标。内皮细胞标记绿色荧光转基因斑马鱼Tg(fli-1:EGFP)、TG（VEGFR2:GFP）系血管荧光转基因斑马鱼和Tg（kdrl:mCherry）转基因斑马鱼常用于调节血管新生方药研究当中。

LIN P 等研究表明当归补血汤可促进血管新生，且黄芪∶当归＝5∶1 时效果最佳，黄芪和黄芪甲苷Ⅳ的效果优于当归和阿魏酸[16]。Hu F 等使用转基因斑马鱼胚胎模型研究丹参葛根汤（丹参、葛根）的血管新生作用，结果表明该方增强了斑马鱼胚胎的肠下血管（SIVs）的萌发[17]。陈锡强等采用血管荧光标记转基因斑马鱼胚胎研究西黄丸（牛黄、麝香、乳香、没药）及其组方药味对斑马鱼节间血管形成的影响，结果显示西黄丸中抑制血管生成作用与单味中药材的活性密切相关，其中乳香与人工牛黄是发挥作用的主要药味[18]。黄志军等将荧光标记的人乳腺癌细胞移植入斑马鱼卵黄囊内建立移植瘤模型，评价小金胶囊（麝香、木鳖子、制草乌等）的抗肿瘤作用；用血管荧光Fli-1 系斑马鱼观察其对新生血管形成的抑制作用，结果表明小金胶囊能诱导细胞凋亡，抑制MCF-7 移植瘤生长和新血管形成，具有潜在的抗肿瘤作用[19]。周忠焱、朱思行等采用VRI 诱导Tg(Fli-1:EGFP)转基因斑马鱼建立血管损伤模型，结果表明通阳活血方（桂枝、三棱、莪术）、活血软坚方（三棱、莪术、海藻、牡蛎）具有促血管新生的作用，其机制可能与其上调 VEGF 受体 VEGFR-1、2、3(flt1、kdr、kdrl)的表达有关[20，21]。Wang Y 等采用 Tg(fli-1a:EGFP)y1 转基因斑马鱼研究得出盐酸川芎嗪和芍药甙通过剂量依赖性方式恢复VRI 诱导的斑马鱼血管不足，二者协同作用更佳[22]。

因评价方式单一，斑马鱼在调节血管新生方药研究中以筛选优效方药及机制研究为主，但配伍剂量比以及药物协同作用也有研究。斑马鱼具有的独特优势使得其在发育与相关疾病研究领域应用广泛，但目前对于机制研究并不深入。

1.3 抗骨质疏松方药研究

斑马鱼是骨形成和骨吸收活动的完整体系[23]，骨骼结构和遗传学与人类有高度的相似性，是用于研究骨骼变形和发育异常的成熟动物模型[24]。斑马鱼在抗骨质疏松药物筛选中观测指标有斑马鱼脊椎骨的荧光强度、鱼骨胶原蛋白马松染色、鱼鳞片钙、磷含量测定、碱性磷酸酶、羟脯氨酸含量测定[25]，骨矿化程度[26，27]等，主要以糖皮质激素地塞米松或泼尼松龙诱导建立斑马鱼骨质疏松模型。

尹恒、钱哲等以糖皮质激素建立斑马鱼骨质疏松模型，研究表明龟鹿二仙胶（鹿角、龟板、人参、枸杞子）对骨质疏松斑马鱼模型鳞片中钙、磷含量均有上调作用，通过上调转化生长因子β（TGF-β）/Smad信号通路的上游蛋白TGF-β1、TGF-β2 及下游蛋白Smad3来实现通路的激活，从而促进I型胶原蛋白的合成与分泌，调控核转录因子ĸB（NF-κB）和活化蛋白（AP-1）抑制炎症反应以治疗骨质疏松[28，29]；左归丸（熟地黄、菟丝子、牛膝、龟板胶、鹿角胶、山药、山茱萸、枸杞子）可通过逆转骨形成/骨吸收的不平衡和激活TGF-β/Smad 信号通路来预防骨质疏松症[30]。景莉君采用泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松模型，研究得出接骨汤具有促进骨生成、防止骨丢失作用[31]。谭登等以泼尼松龙建立斑马鱼骨质疏松模型，采用椎骨荧光面积、碱性磷酸酶（ALP）、骨形态发生蛋白2b（BMP-2b）、人类相关转录因子 2（Runx2）、组织蛋白酶K(CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）、活化T细胞的核因子，细胞质1（NFATC-1)基因表达水平评价了补肾通络方（骨碎补、淫羊霍、白芍、茯苓、续断、全蝎、蜈蚣、炙甘草）干预骨质疏松的效应并进行拆方研究。结果表明，补肾通络方具有抗骨质疏松活性，且通络方（全蝎、蜈蚣）可明显改善骨质疏松，而补肾通络方逆转骨量流失的作用则更为显著，与大鼠模型具有一致性[32]。蒋蓉等人采用对糖皮质激素复制斑马鱼骨质疏松模型，评价桃红四物汤（桃仁、红花、熟地黄、当归、川芎、白芍）以及红花主要成分羟基红花黄A（HYA）的治疗作用及其机制。结果表明，斑马鱼的骨矿化面积和累积光密度值有显著性地升高,且呈剂量依赖性，ALP、I 型胶原蛋白 (type I)、Runx2、血清骨保护素(OPG)、TRACP-5b、骨钙素(OCN)基因的表达也有明显增加, Ca、P、K、Mg、Zn 和Fe 水平均显著高于泼尼松龙组。桃红四物汤通过增强成骨细胞活力,促进骨胶原表达和骨矿化，增加骨量，从而逆转糖皮质激素性骨质疏松且其君药红花主要成分HYA 具有促进骨矿化, 提高成骨细胞活性的作用，说明红花作为君药在桃红四物汤抗糖皮质激素性骨质疏松中发挥重要作用[33，34]。

斑马鱼骨质疏松模型的建立，既保持了在体动物的完整性，又克服了体外实验作用环节单一，难以体现整体模型综合效应的缺陷[35]。此外，有研究者提出基于斑马鱼模型采用M-Act/Tox 一体化评价（中药的效应/毒性产生与其在体内的代谢转化）高效筛选抗骨质疏松中药。该方法是关注体内、外成分，兼顾有效性与安全性的抗骨质疏松筛选新方法[36，37]。斑马鱼模型在抗骨质疏松方药研究中综合展现了其高效、快速、大规模以及整体观察的优势，不仅有对复方的研究，也有对复方拆方以及主要成分的研究，以阐述方剂配伍特点，对中医药抗骨质疏松方药研究具有一定的积极意义。

1.4 抗神经损伤方药研究

斑马鱼的整个神经递质系统包括胆碱能多巴胺能和去甲肾上腺素能通路已经被阐明，相比于其他无脊椎模型生物，斑马鱼出生后3 天就开始发育功能完好的血脑屏障[38]，且斑马鱼体型纤细，胚胎和幼鱼时期透明，四天可形成完整的神经系统，在胚胎时期可观察到成熟完整的中枢神经系统[39]，可通过特殊染色方法在完整的活体状态下快速直观检测出神经系统的器质性损伤[40]。这些都说明了斑马鱼模型在神经系统疾病研究上的优势。

王荣春等建立1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)诱导的斑马鱼神经损伤模型，研究表明芪智消渴颗粒（黄芪、何首乌、益智仁、淫羊藿、雄蚕蛾、熟地、丹参、远志、黄连等）能明显逆转MPTP 造成的游泳行为异常，提高斑马鱼的运动距离[41]。彭超宝等研究显示桂枝甘草龙骨牡蛎汤类方对斑马鱼的运动行为有抑制作用，不同配伍对斑马鱼行为节律影响不同，其作用通路亦不尽相同[42]。Wang M 等建立6-羟基多巴胺诱导的神经损伤模型，结果表明谷精草提取物可以抑制6-羟基多巴胺在斑马鱼上引起多巴胺神经元减少，其作用机制可能与降低一氧化氮（NO）的产生和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达量有关[43]。李晓稳等蛋白组学分析斑马鱼神经元模型损伤药物干预前后总蛋白差异，寻找养血清脑颗粒（当归、川芎、钩藤、白芍、夏枯草等）对斑马鱼神经元损伤预后的生物标记物及其作用机制，为养血清脑颗粒治疗慢性脑供血不足筛选出预后标志物[44]。

目前，组学已经逐渐应用到斑马鱼模型当中，包括基因组学、蛋白组学以及代谢组学，从分子层面上揭示方药多靶点多通路的复杂作用机制。

1.5 其他

除以上研究之外，斑马鱼模型还用于脑出血、脂质代谢、色素研究等方面。如李潇等以辛伐他汀诱导黑色素等位基因突变型Albino 品系斑马鱼建立脑出血模型，探索健脾益气摄血方（党参、白术、茯苓、炙甘草、黄芪、阿胶、茜草）及其拆方的防治效果，得出健脾方（党参、白术、茯苓、炙甘草）和健脾益气方（党参、白术、茯苓、炙甘草、黄芪）对辛伐他汀诱导斑马鱼脑出血无防治效果；健脾益气生血方（党参、白术、茯苓、炙甘草、黄芪、阿胶）与健脾益气摄血方显示有良好防治效果，但高浓度具有毒性[45]。肖红彦以肥胖斑马鱼为模型，从多方面证实地黄提取物可有效抑制斑马鱼的肥胖[46]。韩冰研究表明小檗胺对高血脂斑马鱼具有较好的降血脂效果，其分子机制可能是抑制胆固醇的合成和脂蛋白的组装分泌，促进胆固醇的转运和转化[47]。王天晶研究表明菟丝子水提物对斑马鱼黑素细胞黑色素合成有抑制作用，且斑马鱼模型与其它模型具有较好的一致性[48]。

2 展望

斑马鱼幼鱼是目前为止唯一适合高内涵、高通量、微孔板的脊椎动物模型，适用于中药复杂成分体系，既用于中药物质成分、提取物的研究，也用于单味药、复方研究，在方药研究中的应用逐渐深入。方剂研究是方药研究的重要组成部分，而配伍是方剂的重要环节。上述内容表明斑马鱼模型也可应用于方剂配伍规律研究当中。斑马鱼模型可在应用于方药效应评价和机制研究的基础上，筛选方药活性成分，分析方剂组方配伍特点，探讨方剂最佳药物组成配比等。此外，代谢组学、蛋白质组学等也应用到斑马鱼模型当中，使得模式动物斑马鱼在方药研究中的应用更加丰富和深入。斑马鱼模型也有局限性，例如斑马鱼给药方式以及药物吸收方式与人或其他哺乳类动物模型存在差异，一定程度上可能影响药物效应评价结果；斑马鱼研究方法、检测指标较其他动物模型少，可用的抗体较少，蛋白水平研究存在一定困难。目前，尽管许多方药通过建立斑马鱼模型证实其药效，但研究结果多数局限于相应的效应指标，而对于单体、提取物、复方的作用机制研究尚不深入，需进一步探索。

综上，斑马鱼作为低成本、高效、快速的实验动物模型，理应在中医药发展中充分利用。斑马鱼生物模式处于发展阶段，斑马鱼模型开展中药复方的研究逐渐增多。结合传统中医药理论、临床实践及现代研究进展，未来应用斑马鱼模式生物开展方药配伍规律、剂量关系等研究将是中医药研究的方向之一，对指导中医临床用药具有重要作用。