六味地黄汤对慢性肾衰竭大鼠肾组织ZO-1、N-cadherin及Vimentin表达的影响

唐群，吴华，张熙，刘春燕，董翔，王茜

论著·实验研究

六味地黄汤对慢性肾衰竭大鼠肾组织ZO-1、N-cadherin及Vimentin表达的影响

唐群1，吴华2，张熙2，刘春燕1，董翔1，王茜1

1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.湖南省第二人民医院，湖南 长沙 410007

观察六味地黄汤对慢性肾衰竭大鼠肾组织紧密连接蛋白1（ZO-1）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达的影响，探讨其干预肾间质纤维化的作用机制。健康雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、六味地黄汤组和依那普利组。5/6肾切除术复制慢性肾衰竭模型，各给药组给予相应药物灌胃，每日1次。给药8周后，腹主动脉放血法处死大鼠，检测大鼠肾功能指标，HE染色观察肾组织病理变化，Masson染色观察胶原纤维沉积，免疫组化检测肾组织ZO-1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达。与假手术组比较，模型组大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平明显升高（＜0.05）；肾组织病变明显，大量胶原纤维沉积（＜0.05）；肾组织ZO-1蛋白表达明显降低（＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表达明显升高（＜0.05）。与模型组比较，六味地黄汤组大鼠24 h尿蛋白、血尿素氮和血肌酐水平明显降低（＜0.05）；肾组织病变程度减轻，少量胶原纤维沉积（＜0.05）；肾组织ZO-1蛋白表达明显升高（＜0.05），N-cadherin、Vimentin蛋白表达明显降低（＜0.05）。六味地黄汤通过上调ZO-1的表达，下调N-cadherin、Vimentin的表达，延缓肾间质纤维化，其作用机制与抑制肾小管上皮细胞间充质转化有关。

慢性肾脏病；5/6肾切除术；上皮细胞间充质转化；六味地黄汤；大鼠

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的主要病理特征是肾脏纤维化，上皮细胞间充质转化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是促进肾脏纤维化发生和发展的重要机制[1]。六味地黄汤是临床治疗CKD的有效方剂[2]，但其具体作用机制尚未完全阐明。本研究通过5/6肾切除术复制慢性肾衰竭大鼠模型，观察六味地黄汤对慢性肾衰竭大鼠肾组织紧密连接蛋白1（ZO-1）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）表达的影响，探讨其干预肾间质纤维化的作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物

健康雄性SD大鼠50只，体质量（150±20）g，动物许可证号SYXK（湘）2016-0002，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养于湖南中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室。

1.2 药物

六味地黄汤（熟地黄24 g，酒萸肉12 g，山药12 g，牡丹皮9 g，盐泽泻9 g，茯苓9 g），购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科，所有饮片经鉴定均符合2015年版《中华人民共和国药典》有关规定和标准。饮片进行2次煎煮后过滤，滤液混匀，于水浴恒温器上将药物浓缩至含原药材1 g/mL。马来酸依那普利片，扬子江药业集团股份有限公司，批号19042111，加蒸馏水充分溶化，配制成浓度为1 mg/mL的悬浊液。

1.3 主要试剂与仪器

尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、24 h尿蛋白（24 h UAlb）定量试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号分别为20190602、20190529、20190522；ZO-1、N-cadherin、Vimentin多克隆抗体，北京博奥森生物技术有限公司，批号分别为AH09144321、AG09114506、AG10165239；通用二步法免疫组化检测试剂盒、DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号分别为PV-9000、ZLI-9019。轮转石蜡切片机（德国徕卡RM2235），生物组织摊片机（浙江金迪YD-A），电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司，DNP-9162），BA410显微镜（德国Motic），Motic 6.0数码医学图像分析系统（北京麦克奥迪仪器仪表有限公司）。

1.4 分组及造模

50只健康雄性SD大鼠随机分为假手术组（10只）和手术组（40只）。假手术组打开腹腔暴露肾脏后避免牵拉，肾脏不切除，手术组按照文献[3]方法进行5/6肾切除术造模。造模成功后，将39只大鼠（死亡1只，有大量腹水，考虑腹腔感染）随机分为模型组、六味地黄汤组、依那普利组，每组13只。灌胃第1周模型组和六味地黄汤组各死亡2只和1只，死亡原因均考虑灌胃误吸；灌胃第2周依那普利组死亡1只，死亡原因考虑肠梗阻。死亡大鼠从相应组别直接剔除，最终进入实验的大鼠为假手术组10只、模型组11只、六味地黄汤组12只和依那普利组12只。

1.5 给药

造模成功后第2周起灌胃，六味地黄汤组给予6.75 g/kg六味地黄汤灌胃[4]，依那普利组予10 mg/kg依那普利悬浊液灌胃[5]，假手术组和模型组予10 mL/kg蒸馏水灌胃，每日1次，连续8周。

1.6 标本采集及处理

灌胃8周后，腹主动脉放血法处死大鼠，处死前代谢笼收集24 h尿量测定24 h UA1b，腹主动脉采血检测血BUN和SCr，4%多聚甲醛固定肾组织，用于HE染色和Masson染色，观察肾组织病理变化及胶原纤维沉积程度。免疫组化检测ZO-1、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达。

1.7 肾功能检测

大鼠腹主动脉取血，3000 r/min离心15 min，分离血清，分装后-70 ℃冰箱保存待测。血BUN测定采用二乙酰一肟显色法，SCr测定采用碱性苦味酸比色法，ELISA检测24 h UAlb，严格按试剂盒说明书进行操作。

1.8 病理形态观察

取4%多聚甲醛固定好的肾组织，乙醇脱水、二甲苯透明、62 ℃浸蜡、包埋，制成蜡块，置于4 ℃冰箱保存。肾组织切片（厚约4 μm），分别进行HE染色、Masson染色。HE染色观察肾脏病理变化，进行肾小管间质损伤指数评分[6]。评分指标：肾小管萎缩、扩张、上皮细胞空泡形成、红细胞管型、蛋白管型、白细胞管型、间质水肿、间质炎性细胞浸润。每个指标设4个等级：正常0分，轻度1分，中度2分，重度3分。肾小管间质损伤指数为该标本5个视野评分的平均值。Masson染色观察胶原纤维沉积情况，400倍光镜下每张切片随机选取10个不重复视野，利用Image Pro Plus 6.0软件分析胶原纤维占整个视野百分比。

1.9 免疫组化检测

石蜡切片，常规脱蜡至水；3%H2O2室温孵化15 min，灭活内源性过氧化物酶；蒸馏水进行冲洗后PBS漂洗5 min×2次；抗原修复和封闭，加一抗（1∶50），37 ℃孵育2 h；PBS漂洗5 min×3次；加二抗（1∶100），37 ℃孵育20 min；PBS漂洗5 min×3次；滴加碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min；PBS漂洗5 min×3次；DAB显色；待切片自然风干后，滴入中性树胶封片。400倍光镜下每张切片随机选取5个肾皮质视野进行观察。阳性表达呈浅黄色、棕黄色或棕褐色。采用Motic Med 6.0数码医学图像系统测定分析阳性细胞平均光密度值，蛋白表达越强则平均光密度值越大。

1.10 统计学方法

2 结果

2.1 六味地黄汤对模型大鼠肾功能的影响

与假手术组比较，模型组大鼠24 h UAlb、BUN和SCr水平明显升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，六味地黄汤组和依那普利组大鼠24 h UAlb、BUN和SCr水平均明显降低，差异有统计学意义（＜0.05）；六味地黄汤组和依那普利组组间比较差异无统计学意义（＞0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠24 h UAlb、BUN和SCr水平比较（±s）

注：与假手术组比较，▲＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

2.2 六味地黄汤对模型大鼠肾组织病理形态的影响

2.2.1 HE染色结果

灌胃8周后，假手术组大鼠肾小球结构完整，肾小管上皮细胞排列整齐且基底膜完整，间质少，未见明显炎性细胞浸润；模型组大鼠肾小球硬化、肾小管萎缩、间质纤维组织增生，大量炎性细胞浸润，部分肾小球代偿性肥大、肾小管代偿性扩张，管腔内可见蛋白管型；六味地黄汤组和依那普利组大鼠肾组织病变程度均有改善。与假手术组比较，模型组大鼠肾小管间质损伤指数评分明显升高，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，六味地黄汤组和依那普利组大鼠肾小管间质损伤指数评分均明显降低，差异有统计学意义（＜0.05）；六味地黄汤组和依那普利组组间比较差异无统计学意义（＞0.05）。结果见图1、表2。

2.2.2 Masson染色结果

灌胃8周后，假手术组大鼠肾小球、肾小管形态正常，肾间质未见明显胶原纤维；模型组大鼠肾小球玻璃样变，肾小管萎缩消失，间质纤维化明显，可见大量染成蓝色的胶原纤维；六味地黄汤组和依那普利组大鼠肾小管间质见少量胶原纤维，纤维化程度明显减轻。与假手术组比较，模型组大鼠肾小管间质胶原面积百分比明显增加，差异有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，六味地黄汤组和依那普利组大鼠肾小管胶间质原面积百分比减少，差异有统计学意义（＜0.05）。结果见图2、表3。

图1 各组大鼠肾组织形态（HE染色，×200）

表2 各组大鼠肾小管间质损伤指数评分比较（±s，分）

注：与假手术组比较，▲＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

图2 各组大鼠肾组织形态（Masson染色，×200）

表3 各组大鼠肾小管间质胶原面积百分比比较（±s，%）

注：与假手术组比较，▲＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

2.3 六味地黄汤对模型大鼠肾组织紧密连接蛋白1、N-钙黏蛋白和波形蛋白表达的影响

ZO-1蛋白阳性着色呈浅黄色至棕褐色，主要表达在细胞质。假手术组大鼠肾小管上皮细胞强阳性表达，肾小球未见明显表达，模型组微弱表达，六味地黄汤组和依那普利组表达增强，见图3。N-cadherin蛋白阳性着色呈浅黄色至棕褐色，主要表达在细胞膜和细胞质。假手术组表达不明显，模型组肾小管上皮细胞高表达，尤以基底膜明显，肾小球未见明显表达，六味地黄汤组和依那普利组表达减弱，见图4。Vimentin蛋白阳性着色呈浅黄色至棕黄色，主要表达在肾小管上皮细胞细胞质。假手术组肾小管上皮细胞微弱表达，肾小球不表达，模型组肾小管上皮细胞高表达，尤以远曲小管明显，六味地黄汤组和依那普利组表达明显减弱，见图5。与假手术组比较，模型组大鼠肾组织ZO-1蛋白表达明显降低，N-cadherin、Vimentin蛋白表达明显升高，差异均有统计学意义（＜0.05）；与模型组比较，六味地黄汤组和依那普利组大鼠肾组织ZO-1蛋白表达明显升高，N-cadherin、Vimentin蛋白表达明显降低，差异均有统计学意义（＜0.05）；六味地黄汤组和依那普利组比较差异无统计学意义（＞0.05）。见表4。

图3 各组大鼠肾组织ZO-1蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

图4 各组大鼠肾组织N-cadherin蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

图5 各组大鼠肾组织Vimentin蛋白阳性表达（免疫组化染色，×400）

表4 各组大鼠肾组织ZO-1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达比较（±s）

注：与假手术组比较，▲＜0.05；与模型组比较，#＜0.05

3 讨论

CKD主要病理特点为肾小球硬化、肾小管萎缩消失和肾间质纤维化。控制肾间质纤维化，对于治疗慢性肾脏病、延缓慢性肾衰竭起关键作用[7]。EMT是肾间质纤维化的重要机制之一。20世纪90年代中期Strutz[8]首先提出成年动物肾小管上皮细胞可转变为间充质的成纤维细胞，进而推测成年动物肾脏也可发生EMT。近年来Strutz假说得到大量证据的支持，EMT在肾间质纤维化的进展中起着至关重要的作用[9]。EMT过程中，成熟的上皮细胞丧失其上皮表型，而获得未成熟的间充质表型，可表现为上皮细胞表型如细胞角蛋白、ZO-1、E-cadherin逐渐丧失，而间质细胞表型如Vimentin、纤维连接蛋白、N-cadherin、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达增加[10-11]。

CKD属中医学“水肿”“关格”“癃闭”等范畴。六味地黄丸（汤）出自宋代钱乙《小儿药证直诀》，由熟地黄、山萸肉、山药、泽泻、茯苓、牡丹皮组成，其组方严谨，配伍得当，具有三补三泻的特点。中医探讨肾间质纤维化病因及发病机制，提出“虚、痰（浊）、瘀、毒”四大病机学说[12]，其中虚是肾间质纤维化的始动因素，痰（浊）、瘀是构成肾间质纤维化的病理基础，而毒是加重肾间质纤维化不可忽视的方面。针对其四大病机，六味地黄汤“三补三泻”，既补肾虚，又能化痰（浊）、去瘀、毒。本实验结果显示，与模型组比较，六味地黄汤组大鼠24 h UAlb、BUN、SCr水平均明显降低（＜0.05），光镜下大鼠肾小球硬化、肾小管萎缩和间质纤维化程度明显减轻，肾小管间质损伤指数评分明显降低，肾小管间质胶原面积百分比明显下降（＜0.05），提示六味地黄汤能明显改善5/6肾切除大鼠肾功能，减轻肾组织病理变化和胶原纤维沉积，对慢性肾衰竭大鼠有明显的治疗作用。

为进一步阐明六味地黄汤防治CKD的作用机制，本研究从EMT的角度，进一步观察六味地黄汤对5/6肾切除大鼠肾组织ZO-1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达的影响。ZO-1是与紧密连接相关的蛋白，主要存在于上皮细胞、内皮细胞间连接复合体中，可维持机体内环境稳定，保持上皮细胞的极性，影响细胞的运动、增殖、分化，调节细胞功能。N-cadherin是钙黏蛋白家族中一个经典成员，正常主要在神经组织和间叶细胞中表达，起细胞间黏附作用。Vimentin是间叶细胞骨架中间纤维的主要组成成分，广泛分布于间充质细胞。因此，ZO-1是上皮细胞的重要蛋白标志，而N-cadherin和Vimentin是间充质细胞的重要蛋白标志。熊飞等[13]研究发现，高糖腹膜透析液可引起腹膜间皮细胞的损伤，影响紧密连接和ZO-1的表达，促进EMT的发生，引起腹膜纤维化。Heuberger等[14]研究发现，N-cadherin的表达有助于血管形成及EMT发生，从而使肿瘤细胞更加富于侵袭力，易于转移。王雪瑶等[15]研究发现，转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的HK-2细胞中E-cadherin表达明显降低甚至消失，而α-SMA和Vimentin表达明显升高，促进EMT的发生，且表型转化能力与TGF-β1的剂量有关。因此，ZO-1、N-cadherin、Vimentin参与肿瘤的侵袭与转移或纤维化过程，其机制均与EMT的发生有关。本研究结果显示，与模型组比较，六味地黄汤组大鼠肾组织ZO-1蛋白表达明显升高，而N-cadherin、Vimentin蛋白表达不同程度降低，差异均有统计学意义（＜0.05），提示六味地黄汤能上调慢性肾衰竭大鼠上皮细胞表型标记物，同时下调间叶细胞表型标记物，可通过抑制肾小管上皮细胞间充质转化发挥抗纤维化的作用。

综上所述，CKD发生机制复杂，目前尚未完全阐明，其主要病变特征是肾脏纤维化，而EMT在肾脏纤维化发生发展过程中有重要作用。六味地黄汤防治CKD的作用机制可能与其抑制EMT的发生有关。

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Effects ofDecoction on Expressions of ZO-1, N-cadherin andVimentinin Renal Tissue of Rats with Chronic Renal Failure

TANG Qun1, WU Hua2, ZHANG Xi2, LIU Chunyan1, DONG Xiang1, WANG Xi1

To observe the effects ofDecoction on the expressions of ZO-1, N-cadherin and Vimentin in renal tissue of rats with chronic renal failure; To explore its mechanism in the renal interstitial fibrosis.Healthy male SD rats were randomly divided into sham-operation group, model group,Decoction group and Enalapril group. 5/6 nephrectomy was performed to replicate chronic renal failure model. Rats in each administration group were given intragastric administration once a day. 8 weeks after medication, the rats were killed by abdominal aorta bleeding. Renal function was measured. Pathological changes were observed by HE staining. Collagen fiber deposition was observed by Masson staining. The expressions of ZO-1, N-cadherin, Vimentin protein were detected by immunohistochemistry.Compared with sham-operation group, 24 h urinary protein, blood urea nitrogen and serum creatinine in model group significantly increased (<0.05), renal tissue lesions significantly increased (<0.05), collagen fiber deposition significantly increased (<0.05); the protein level of ZO-1 protein in renal tissue significantly decreased (<0.05), and the protein levels of N-cadherin and Vimentin significantly increased (<0.05). Compared with the model group, the levels of 24 h urine protein, blood urea nitrogen and serum creatinine were significantly decreased (<0.05) in theDecoction group, and the degree of renal lesion was reduced, a small amount of collagen deposition appeared (<0.05); the protein level of ZO-1 protein increased (<0.05), while the protein levels of N-cadherin and Vimentin decreased (<0.05).Decoction can delay renal interstitial fibrosis by up-regulating the expression of ZO-1 and down-regulating the expressions of N-cadherin and Vimentin, and the mechanism may be related to the inhibition of renal tubular epithelial-mesenchymal transformation.

chronic kidney disease; 5/6 nephrectomy; epithelial-mesenchymal transformation;Decoction; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)12-0032-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005340

国家自然科学基金（81503442、81603470）；湖南省教育厅科研项目（17B197）

（2020-05-19）

（2020-06-02；编辑：华强）