维吾尔药睡莲花基原及质量控制研究

刘新桥，沙拉麦提•艾力，斯拉甫•艾白，汪波，陈亚飞，梅之南

维吾尔药睡莲花基原及质量控制研究

刘新桥1，沙拉麦提•艾力2，斯拉甫•艾白3，汪波4，陈亚飞1，梅之南1

1.中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074；2.新疆维吾尔自治区食品药品检验所，新疆 乌鲁木齐 830002；3.新疆维吾尔自治区维吾尔医研究所，新疆 乌鲁木齐 830049；4.湖北省药品监督检验研究院，湖北 武汉 430075

通过分析睡莲花样品的基原及特征性成分烟花苷和紫云英苷含量，为睡莲花的基原确认和质量控制提供依据。以核糖体DNA第二内部转录间隔区（ITS2）为主体条形码序列进行基原鉴定。采用HPLC测定烟花苷和紫云英苷含量，Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为乙腈、B为0.2%磷酸溶液（含1.0%四氢呋喃），梯度洗脱（0～65 min，15%→11%A；65～75 min，11%→25%A；75～80 min，25%→15%A；80～90 min，15%A），流速1.0 mL/min，检测波长350 nm，柱温30 ℃。ITS2序列可将睡莲花与其近源物种很好区分。特征性成分烟花苷和紫云英苷分离度良好，供试品溶液在24 h内稳定；烟花苷回归方程为＝31.09－12.142（＝0.999 9），紫云英苷回归方程为＝13.304－11.25（＝0.999 5），均具有良好的线性关系；重复性试验RSD＜2.0%；烟花苷和紫云英苷平均回收率分别为99.44%和98.88%。DNA条形码可准确鉴定维吾尔药睡莲花的基原，结合特征性成分烟花苷和紫云英苷含量测定，可较全面控制睡莲花的质量。

睡莲花；DNA条形码；烟花苷；紫云英苷；含量测定

睡莲花为睡莲科植物雪白睡莲Presl.的干燥花蕾，主要分布于我国新疆伊犁、阿勒泰和博湖地区[1]，以及巴基斯坦、印度等国。睡莲花为维吾尔医习用药，称为“内鲁帕尔”，具有降热止咳、益心护脑、安神止痛、祛乃孜来功效，临床主要用于治疗感冒发热、头痛咳嗽、心悸不安、咽痛或热证引起的头痛、热感咳嗽及小儿急、慢惊风等病症，其标准收载于《中华人民共和国卫生部药品标准•维吾尔药分册》[2]。现代药理研究表明，睡莲花具有抗氧化、抗炎、降血糖等多种生物活性[3-6]。据报道，黄酮类成分烟花苷和紫云英苷是睡莲花主要的特征性成分[7]。目前，部颁标准仅收载睡莲花的性状及显微鉴别方法，而传统鉴别方法很难确定药材基原。鉴于此，本研究收集19批市售睡莲花样品，以核糖体DNA第二内部转录间隔区（ITS2）为主体条形码序列进行鉴定，并对药材性状特征进行分析，采用HPLC测定特征性成分烟花苷和紫云英苷含量，为全面评价维吾尔药睡莲花的质量提供依据。

1 仪器与试药

Bio-Rad T100PCR仪，Bio-Rad公司；EPS-301凝胶电泳仪，美国Amersham公司；MM400球磨仪，德国Retsch公司；Agilent 1260高效液相色谱仪（DAD检测器），美国Agilent公司；Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国Agilent公司；SYZF 10L型超纯水制造系统，成都渗源科技有限公司；CP214电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；KQ-500E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。

快捷型植物基因组提取试剂盒（DP321，天根生化科技有限公司），鉴别引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR扩增及测序引物正向5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’、反向5’-GAC GCTTCTCCAGACTACAAT-3’。烟花苷对照品（批号180603，纯度＞98%，上海融禾医药科技有限公司），紫云英苷对照品（批号180509，纯度＞98%，上海融禾医药科技有限公司），甲醇（美国TEDIA，色谱纯），磷酸（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），超纯水（实验室自制）。睡莲花样品于2017年4月－2018年7月于新疆全区、云南、湖北及荷兰、巴基斯坦等地收集，见表1。

表1 睡莲花样品来源信息

样品编号批号采集/收购时间产地/提供厂家 S1201710122017年10月巴基斯坦/和田达瓦衣店（收购） S2Y17090502017年9月湖北清大中药饮片有限公司（厂家提供） S3Y17090222017年9月新疆维草集药材有限公司（厂家提供） S4H301341022017年8月新疆麦迪森维药有限公司（厂家提供） S5SLH-YP-1708302017年8月新疆恩萨尔维吾尔医饮片药业有限公司（厂家提供） S6201707112017年7月巴基斯坦（收购） S7201709032017年9月新疆博湖（收购） S8201709062017年9月新疆和田（收购） S9201709222017年9月新疆精华维吾尔药业有限公司（厂家提供） S10201709042017年9月新疆博湖（收购） S11201709032017年9月新疆伊犁（收购） S1217060182017年6月新疆维草集药材有限公司（厂家提供） S13Y17090092017年9月新疆维草集药材有限公司（厂家提供） S141704222017年4月巴基斯坦（收购） S15U8-12017年8月云南昆明（收购） S16201710112017年10月和田达瓦衣店（收购） S17201708092017年8月新疆伊犁（收购） S18201807202018年7月荷兰Harsteeg（采集） S19201807152018年7月中国科学院武汉植物园（采集）

2 方法与结果

2.1 性状特征与鉴别

雪白睡莲呈圆锥形或长圆形，花蕾长2.5～4 cm，直径约2 cm，花托略呈方形；花萼4枚，革质，长卵状披针形，表面灰绿色或棕黄色；剥去花萼可见白色花瓣15～25枚，卵圆形；花药线形，长约10 mm，花丝扁平，几与花药等长；子房球形或椭圆形，无花柱或极短，柱头具6～14辐射线；气微，味淡。

白睡莲本种与雪白睡莲主要区别为花托呈圆柱形；柱头具14～20辐射线。

柔毛齿叶睡莲本种与雪白睡莲主要区别为萼片矩圆形；花瓣12～14枚，先端圆钝，具5纵条纹；柱头具12～15辐射线，具附属物。

睡莲本种与雪白睡莲主要区别为花瓣宽披针形、长圆形或倒卵形；花药条形，长3～5 mm；柱头具5～8辐射线。

雪白睡莲、白睡莲、柔毛齿叶睡莲、睡莲的干燥花在性状上有一定差异，但区别较小，部分品种具有连续的数量性状特征，且干花的辐射线等特征不易观察区分，不宜完全凭借性状特征进行基原鉴定。

2.2 DNA条形码分子鉴定

2.2.1 模板DNA提取、PCR扩增及产物检测

按2015年版《中华人民共和国药典》四部通则9107“中药材DNA条形码分子鉴定法”。利用新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA，采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）测定OD260/OD280比值及DNA浓度。PCR反应体系30 μL，包括10×PCR缓冲液3 μL、二氯化镁（25 mmol/L）2.4 μL、dNTP（10 mmol/L）0.6 μL、鉴别引物（30 μmol/L）各0.5 μL、高保真Taq DAN聚合酶（5 U/μL）0.2 μL、模板l μL、无菌超纯水21.8 μL。反应参数：95 ℃预变性4 min，循环反应（95 ℃、30 s，55～58 ℃、30 s，72 ℃、30 s）30次，72 ℃延伸5 min。PCR产物纯化后使用ABI3730XL测序仪双向测序，测序峰图利用CodonCode Aligner V3.7.1（CodonCode Co.，USA）校对拼接，所有序列用MEGA6.05软件进行分析及ClustalW多序列比对，并用邻接法（NJ）构建系统进化树，采用bootstrap（1000次重复）检验各分支支持率。为进一步对物种进行准确鉴定，采用BLAST局部比对法，通过GenBank数据库（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/）对所获ITS2序列进行检索，设置E值为1×10-10。

2.2.2 睡莲花及其近源物种系统进化树鉴别

基于ITS2序列构建的包含睡莲科睡莲属睡莲、白睡莲、雪白睡莲、柔毛齿叶睡莲var.、延药睡莲及睡莲科芡属芡实、萍蓬草属欧亚萍蓬草、萍蓬草等物种的NJ系统进化树见图1。睡莲花基原雪白睡莲与同科近源物种能够较好区分，雪白睡莲聚为一支，且分支支持率达96%，ITS2序列作为DNA条形码可准确鉴定睡莲花，将其与近源物种有效区分。睡莲花基原雪白睡莲及其近源物种鉴定结果见表2。

图1 睡莲花及其近源物种NJ系统进化树

表2 睡莲花样品DNA分子鉴定结果

样品编号相似度/% 鉴定结果拉丁名 S199.59柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S299.59柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S399.59柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S499.59柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S599.00柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S698.35柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S799.59柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S899.00柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S999.59柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S1089.00睡莲Nymphaea tetragona S1193.36白睡莲Nymphaea alba S1299.59柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S1382.00睡莲Nymphaea tetragona S1499.00柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S1599.18柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S1699.00柔毛齿叶睡莲Nymphaea lotus var. pubescens S1799.56白睡莲Nymphaea alba S1898.00白睡莲Nymphaea alba S1998.00雪白睡莲Nymphaea candida

2.3 含量测定

2.3.1 对照品溶液制备

分别取烟花苷、紫云英苷对照品适量，精密称定，各加甲醇制成每1 mL分别含烟花苷2.0 mg和紫云英苷0.8 mg的溶液，再分别取0.5 mL置同一25 mL容量瓶中，加适量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85）稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含烟花苷40 μg和紫云英苷16 μg的混合溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液制备

取本品粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，置圆底烧瓶中，蒸去甲醇，加入适量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85），振摇，转移至25 mL容量瓶中，再加混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85）稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3.3 色谱条件

采用Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相A为乙腈、B为0.2%磷酸溶液（含1.0%四氢呋喃），梯度洗脱（0～65 min，15%→11%A；65～75 min，11%→25%A；75～80 min，25%→15%A；80～90 min，15%A），流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，检测波长350 nm，进样量10 μL。

2.3.4 系统适用性

取“2.3.1”项下对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样检测，重复测定6次，结果烟花苷、紫云英苷峰的理论塔板数平均值分别为7140、6321，峰面积RSD分别为0.44%、0.57%，符合系统适用性要求。

2.3.5 分离度

分别取“2.3.1”项下对照品溶液及“2.3.2”项下供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样，供试品中烟花苷和紫云英苷峰与相邻峰的分离度均大于1.5，对照品溶液和供试品溶液代表性图谱见图2。

注：A.混合对照品；B.供试品；1.烟花苷；2.紫云英苷

2.3.6 检测限和定量限

取“2.3.1”项下对照品溶液，倍比稀释，按“2.3.3”项下色谱条件进样，记录峰面积，当信噪比为3∶1时得检测限，信噪比为10∶1得定量限。结果表明，烟花苷检测限为1.0 µg/mL，定量限为3.0 µg/mL；紫云英苷检测限为1.0 µg/mL，定量限为2.0 µg/mL。

2.3.7 线性关系考察

分别取烟花苷和紫云英苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含烟花苷2.0 mg和紫云英苷0.8 mg的混合对照品溶液，作为对照品贮备液。分别取对照品贮备液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mL置25 mL容量瓶中，各加适量混合溶液（乙腈∶0.2%磷酸＝15∶85）稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的系列对照品溶液。取各不同浓度的系列对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样检测。以峰面积为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。烟花苷回归方程为＝31.09－12.142（＝0.999 9），线性范围为4.004～80.073 μg/mL；紫云英苷回归方程为＝13.304－11.25（＝0.999 5），线性范围为1.612～32.236 μg/mL。结果表明，烟花苷和紫云英苷进样量与峰面积线性关系良好。

2.3.8 精密度试验

取本品，按“2.3.2”项下方法制备6份供试品溶液，取“2.3.1”项下对照品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算样品中烟花苷和紫云英苷的含量。结果显示，烟花苷平均含量为0.37%，RSD＝1.56%；紫云英苷平均含量为0.18%，RSD＝1.41%。表明精密度良好。

2.3.9 稳定性试验

取“2.3.2”项下供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.3.3”项下色谱条件进样，记录色谱图，结果烟花苷和紫云英苷峰面积RSD分别为1.03%、1.68%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.10 加样回收率试验

取同一批已知含量的睡莲花样品粉末，精密称定，每份约0.50 g，置具塞锥形瓶中，分别按已知含量的80%、100%、120%加入烟花苷和紫云英苷对照品，按“2.3.2”项下方法制备，按“2.3.3”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算样品中烟花苷和紫云英苷含量及加样回收率，结果见表3。表明本方法的回收率良好。

2.3.11 样品测定

取19批睡莲花样品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样检测，记录色谱图，计算样品中烟花苷和紫云英苷的含量，结果见表4。

表3 烟花苷和紫云英苷加样回收率试验

成分取样量 /mg样品中 含量/mg加入 量/mg测得 量/mg回收率 /%平均回 收率/%RSD /% 烟花苷207.80.401 50.320 80.716 898.3099.441.87 207.50.400 90.320 80.714 597.76 204.70.395 50.320 80.722 4101.91 214.50.414 40.401 00.804 797.33 206.90.399 70.401 00.808 5101.94 211.40.408 40.401 00.807 199.42 208.70.403 20.481 20.885 4100.21 210.10.405 90.481 20.874 397.34 202.40.391 00.481 20.875 9100.76 紫云英苷257.80.260 90.200 20.459 199.0098.881.67 263.50.266 70.200 20.461 297.17 259.10.262 20.200 20.460 098.80 252.50.255 50.250 20.504 999.67 264.30.267 50.250 20.512 397.85 258.70.261 80.250 20.517 7102.28 251.90.254 90.300 20.555 7100.19 264.80.268 00.300 20.561 097.61 263.20.266 40.300 20.558 797.38

表4 睡莲花样品中烟花苷和紫云英苷含量测定结果（%）

样品编号烟花苷紫云英苷 样品编号烟花苷紫云英苷 S10.110.05 S110.310.16 S20.04未检出 S120.230.07 S30.260.08 S130.220.09 S40.170.08 S140.250.01 S50.190.08 S150.180.05 S60.240.07 S160.240.08 S70.240.08 S170.210.11 S80.16未检出 S180.190.10 S90.220.09 S190.080.03 S100.280.09

3 讨论

维吾尔药来源复杂，在长期用药过程中，由于翻译错误、鉴定错误、代用混用等原因，药材质量标准整体偏低，药材监管难度大，诸多维吾尔药材的来源无法追溯，考证难度较大。本研究收集的睡莲花样品主要来源于维吾尔医药市场，鉴定结果表明，市售睡莲花以柔毛齿叶睡莲居多，而部颁标准中收载的雪白睡莲仅收集到1批。长期误用混用不仅影响了维吾尔药材标准的权威性，也造成了临床用药安全隐患。DNA条形码技术可追溯药材的基原，用于药材的快速、准确鉴定，在质量标准制定、药材流通和市场监理等实际应用中具有重要价值。

睡莲花药用历史久远，是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药的主要组成药物，由于长期依赖于进口，导致基原不清、产地不明，传统的形态学鉴定对于区分不同种质资源存在一定的难度。本研究结果表明，DNA条形码技术具有通用性强、鉴定结果可靠、重复性良好等优点，可用于鉴定睡莲花基原植物雪白睡莲及其近源物种。

本研究建立了HPLC同时测定睡莲花中特征性成分烟花苷和紫云英苷的方法。试验考察了不同浓度甲醇对2种成分的提取效果，结果发现甲醇提取的含量最高，因此选择甲醇作为提供溶剂。在耐用性试验中，通过改变流动相流速（0.9、1.0、1.1 mL/min）、柱温（28、30、32 ℃）评估检测条件的微小变动对测定结果的影响，结果表明，当流动相流速和柱温发生较小的变化时，对烟花苷和紫云英苷含量测定结果没有影响。

[1] 刘勇民.维吾尔药志(下)[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社,1999：541.

[2] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册[M].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社,1998：41.

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[6] 赵军,徐芳,吉腾飞,等.睡莲属植物化学成分及生物活性研究进展[J].天然产物研究与开发,2014,26(1)：141-147.

[7] 赵军,闫明,贺金华,等.维药睡莲花中的黄酮醇苷类成分分析[J].中国现代应用药学,2008,25(2)：115-117.

Study on Original Plant and Quality Control of Uygur Medicine Nymphaeae Flos

LIU Xinqiao1, SHALAMAITI Aili2, SILAFU Aibai3, WANG Bo4, CHEN Yafei1, MEI Zhinan1

To comprehensively analyze the original plant of Nymphaeae Flos and the contents of two main compounds (nicotiflorin and astragalin); To provide the evidence for the origin as certainment and quality control of Nymphaeae Flos.The second inside transcription silent region (ITS2) was used as the main barcodes sequence to identify the original plant. The contents of nicotiflorin and astragalin were determined by HPLC on Agilent ZORBAX SB-Aq C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), with the mobile phase of methanol (A)-0.2% phosphoric acid solution (containing 1.0% tetrahydrofuran) (B) in a gradient mode (0-65 min, 15%→11%A; 65-75 min, 11%→25%A; 75-80 min, 25%→15%A; 80-90 min, 15%A); the flow rate was 1.0 mL/min; the detection wavelength was set at 350 nm; the column temperature was 30 ℃.The system evolutionary tree showed that ITS2 sequence could make it easy to distinguish Nymphaeae Flos from the related species. Under the established chromatographic conditions, good separation and linearity were obtained for the nicotiflorin and astragalin. The regression equations were=31.09-12.142 (=0.999 9) and=13.304-11.25 (=0.999 5); the RSD of the replicate test was less than 2.0%; the average recovery rates were 99.44% and 98.88%.DNA barcode can identify Nymphaeae Flos accurately. Combining with the content determination of the characteristic compounds of nicotiflorin and astragalin, the quality of Nymphaeae Flos can be controlled comprehensively.

Nymphaeae Flos; DNA barcode; nicotiflorin; astragalin; content determination

R284.1

A

1005-5304(2020)12-0059-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004143

国家重点研发计划（2018YFC1708004）

梅之南，E-mail：meizhinan@163.com

（2020-04-06）

（2020-05-14；编辑：陈静）