炎症性肠病发病机制和诊疗研究现状：miRNAs与肠道免疫和屏障功能*

李宝悦 卜祥点 陈文轩 马 娜 张目涵 冯百岁

郑州大学第二附属医院消化内科(450014)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)主要包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD)，是以肠道黏膜免疫细胞和促炎细胞因子聚集为特征的非特异性肠道炎症性疾病，其病因与肠黏膜上皮屏障损伤、肠道微生态紊乱、遗传易感性、宿主自身免疫等因素密切相关。微RNAs(miRNAs)是一组由基因组编码的长度约22个核苷酸残基的高度保守的短链非编码RNA，可与目标mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)结合，通过转录后水平的调节在多种自身免疫病和肿瘤的发病中起重要作用。随着对miRNAs了解的增加，认为miRNAs可调节IBD患者的促炎细胞因子表达和免疫细胞功能，影响肠黏膜屏障完整性，改变肠道共生菌群组成和毒力，并将为IBD的诊断和治疗带来新思路和方法。本文就miRNAs与肠道促炎细胞因子、免疫细胞和肠黏膜屏障功能，以及miRNAs在IBD发病机制中的作用作一综述。

一、MiRNAs与促炎细胞因子和免疫细胞

1. MiRNAs与Th1/Th17细胞：初始T细胞可分化为Th1和Th17细胞，这两种细胞的发育和效应过程可由STAT和NF-κB激活[1-2]。TNF-α可调节CD4+T细胞中miRNAs表达，进一步激活STAT和NF-κB，影响Th1/Th17细胞分化。He等[3]发现，TNF-α可上调CD4+T细胞中miR-301a表达，后者通过靶向抑制Smad核内相关蛋白1(SNIP1)上调NF-κB通路活性，促进IBD患者外周血CD4+T细胞向Th17细胞分化并上调IL-17A、TNF-α、RORC表达。Mycko等[4]对自身免疫性脱髓鞘病的研究发现，miR-301a通过激活IL-6介导的STAT3途径促进Th17细胞分化，这一作用与STAT通路激活抑制蛋白(PIAS)的下调有关。此外，IL-6、IL-23、IL-12和TNF-α可明显抑制IBD患者外周血CD4+T细胞中miR-219a-5p表达，miR-219a-5p的降低通过靶向转录因子ETV5使STAT3和STAT4磷酸化，促进CD4+T细胞分化为Th1/Th17细胞并产生IFN-γ、IL-17A、IL-21和TNF-α等促炎细胞因子[5]。由此可见，miRNAs在CD4+T细胞分化和促炎细胞因子表达中发挥了中间调节的作用。

2. MiRNAs与Th2细胞和嗜酸性粒细胞：Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-13，IL-13可加速纤维化、损伤肠上皮细胞并破坏黏膜屏障功能，与UC发生密切相关[1]。MiRNAs可影响Th2细胞增殖和细胞因子分泌从而在哮喘的发生中起重要作用，但对UC患者的调节机制尚未明确。在过敏原诱导的气管过敏性炎症模型中，miR-155参与了CD4+T细胞活化、Th2细胞增殖和细胞因子的分泌，并介导嗜酸性粒细胞在炎症组织聚集[6-7]。MiR-221-3p在小鼠哮喘模型中可靶向抑制CXC趋化因子配体17(CXCL17)，通过p38MAPK通路使IL-13介导的CCL24和CCL26表达增加，加重气管炎症和嗜酸性粒细胞聚集[8]。Liang等[9]发现，miR-218-5p可抑制气管上皮细胞中CCL26表达，对Th2细胞介导的嗜酸性粒细胞炎症发挥保护作用。但miRNAs是否也参与了IBD患者Th2细胞的免疫功能调节和UC患者炎性组织中嗜酸性粒细胞的浸润仍需更多实验证实。

3. MiRNAs与Treg细胞：Treg细胞表达叉头状转录因子Foxp3并分泌TGF-β和IL-10，发挥免疫抑制作用。其中自然Treg细胞(nTreg细胞)和诱导Treg细胞(iTreg细胞)与IBD的关系最为密切[1]。胸腺发育时期Dicer酶缺失导致的miRNAs成熟障碍会引起nTreg细胞发育和迁移障碍，影响Foxp3表达，并损伤Treg细胞的免疫抑制功能和IL-10、IL-35的分泌，诱发自身免疫病[10]。Lu等[11]发现，miR-155缺失小鼠nTreg和iTreg细胞数量和比例均减少，且miR-155可通过抑制细胞因子信号抑制因子1(SOCS1)促进IL-2信号通路激活和STAT5磷酸化，有利于Treg细胞发挥竞争优势并维护细胞增殖潜能和表型稳定。而在小鼠结肠炎模型中，TNF-α介导的Treg细胞免疫抑制功能的破坏与miR-106a高表达有关，后者通过结合NF-κB启动子抑制IL-10释放的转录后调控[12]。总之，miRNAs可通过影响Treg细胞稳态参与IBD的发病。

4. MiRNAs与抗原呈递细胞(APC)：肠黏膜固有层树突细胞(DC)和巨噬细胞是IBD患者炎症组织中最为关键的APC，可分泌IL-1、IL-6、IL-12家族和TNF-α等促炎细胞因子[13]。Asadirad等[14]使用外泌体传递miR-155并与DC进行体外培养，结果显示miR-155可促进未成熟DC树突形成和胞质空泡化并升高CD40、CD83、CD86表达，诱导效果类似于脂多糖(LPS)。且miR-155还可促进DC分泌IL-12p70和促进T细胞增殖。在IBD患者肠道炎症组织中，miR-10a可靶向抑制单核细胞源性树突细胞(MODC)中IL-12/IL-23p40表达并抑制DC活化，阻碍CD4+T细胞分化[15]。

巨噬细胞可分为经典激活(M1)巨噬细胞和替代激活(M2)巨噬细胞，其极化过程需STAT家族、NF-κB、干扰素调节因子(IRF)等转录因子参与[16]。Xu等[17]发现Akt1缺失小鼠的巨噬细胞通过miR-155/SOCS1轴使NF-κB的活化作用增强，从而促进M1巨噬细胞极化，增加IL-6、TNF-α和活性氮中间体的分泌，在金黄色葡萄球菌的感染中表现出更明显的急性炎症反应和更强的杀菌作用。Zhang等[18]对小鼠骨髓来源的巨噬细胞进行体外培养发现，miR-155缺失可抑制M1巨噬细胞极化，同时通过提高STAT6磷酸化水平促进M2巨噬细胞极化。尼古丁可通过作用于α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)上调巨噬细胞表达miR-124，后者通过靶向STAT3减少IL-6的分泌，发挥炎症抑制作用[19]。

5. MiRNAs与中性粒细胞和B细胞：IBD活动期可见中性粒细胞浸润和数量增加，在疾病缓解期减少。MiR-129-2-3p作用于靶基因Casp6和Ccr2，影响中性粒细胞炎症反应和凋亡过程，其高表达可促进2型糖尿病小鼠的皮肤伤口愈合[20]。MiR-223下调IL-6从而间接抑制p47phox，故miR-223缺失小鼠更易发生酒精介导的肝脏中性粒细胞浸润和活性氧的产生[21]。Hsa-miR-4780和hsa-miR-3938通过调控N2型肿瘤相关中性粒细胞，参与结直肠癌的侵袭和转移[22]。但miRNAs对中性粒细胞功能的调控与IBD活动期的关系仍需行更多的实验证实。此外，miR-155参与了肠系膜淋巴结的生发中心B细胞激活和抗体分泌过程，使小鼠血清抗-dsDNA IgM、IgG、IgA和抗Ro60/SSA IgG、抗-La/SSB IgG显著升高，这可能介导了多种自身免疫病的发生[23]。

二、MiRNAs与肠黏膜屏障

肠黏膜屏障阻止了食物和肠道微生物与固有层免疫细胞接触引发的自身免疫反应，并为抗菌分子高浓度富集提供环境，参与上皮细胞物质转运、信号转导等过程。虽然肠上皮屏障损伤与IBD发病的因果关系目前尚未明确，但有报道显示CD患者一级亲属的肠黏膜上皮对大分子的通透性升高，且这种通透性改变可出现在CD发病前[24]。MiRNAs参与调节肠上皮屏障通透性，在IBD发病中起有作用。

1. MiRNAs与肠黏膜细胞屏障：肠上皮细胞、细胞间连接等共同构成肠黏膜细胞屏障。细胞间连接主要包括紧密连接和黏附连接等。MiRNAs在肠黏膜上皮细胞增殖、凋亡、细胞分化、损伤修复、上皮-间质转化等过程中发挥重要作用。MiR-200b可增加细胞周期S期并减少G1期，增加cyclin D1蛋白表达，改变细胞周期，促进肠上皮细胞增殖。此外，miR-200b还可通过靶向抑制ZEB1和SMAD2表达促进E-钙黏蛋白(E-cadherin)并抑制波形蛋白(vimentin)表达，阻碍上皮细胞向间质细胞转化[25]。尼古丁介导的miR-124上调可加速IL-6诱导的Caco-2细胞增殖和迁移，并减少IL-8和TNF-α的释放[19,26]。Tian等[27]发现miR-31缺失小鼠在DSS诱导过程中表现出结肠上皮细胞增殖减少且细胞凋亡增加。Dalmasso等[28]发现Caco2-BBE细胞和HT29-Cl.19A细胞不同分化时期的miRNAs表达谱不同，以miR-99b、miR125a-5p、anti-miR-1269转染Caco2-BBE细胞后，细胞生长速率和跨上皮电阻明显降低，并表现出HT29-Cl.19A细胞的表型，提示miRNAs参与人肠上皮细胞分化。

MiRNAs对细胞间连接蛋白也具有调节作用。Nakata等[29]发现，miR-21-5p可与其靶点PTEN、PDCD4结合，分别通过PI3K/Akt、JNK/AP-1通路，增加AFR4表达，抑制肠黏膜上皮细胞间紧密连接组成蛋白claudin-4和occludin表达。MiR-15a可在TNF-α的诱导下抑制细胞分裂周期蛋白42(CDC42)，从而降低ZO-1蛋白和E-cadherin表达，破坏紧密连接和黏附连接[30]。

2. MiRNAs与肠黏膜分泌屏障：分泌屏障是位于肠上皮细胞管腔侧的厚黏液层，相当于肠黏膜的化学和免疫屏障，其主要由黏蛋白、免疫球蛋白(sIgA、IgG、IgM等)、抗菌肽、凝集素、肠三叶肽(ITF/TFF3)等组成[31]。在miR-146a缺失小鼠的小肠细胞中，C型凝集素抗菌肽Reg3家族和MUC3、MUC4基因表达明显升高，且肠道集合淋巴结(Peyer’s Patch)中滤泡辅助T细胞(Tfh细胞)和生发中心B细胞数量明显增加，两者相互作用的增强可促进生发中心B细胞分泌IgA，这一系列变化提示低浓度miR-146a有助于维持肠黏膜屏障的完整性[32]。在DSS诱导的结肠炎小鼠Treg细胞中，miR-155通过抑制细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)，减少滤泡调节性T细胞(Tfr细胞)的产生，Tfr细胞快速下降可导致小鼠肠系膜淋巴结内的生发中心B细胞大量增多并产生多种免疫球蛋白，可能与IBD、其他自身免疫病的发病机制有关[23]。此外，Guo等[33]发现miR-7-5p可通过抑制PI3K/Akt信号通路使TFF3表达减少，抑制肠上皮黏膜细胞增殖和损伤组织修复。有研究[34]发现抑制miR-7可升高TNBS诱导的结肠炎小鼠中的TFF3表达，对IBD起有保护作用。因此，miRNAs的稳定表达有助于维持肠黏膜分泌屏障功能。

3. MiRNAs与肠黏膜生物屏障：肠道微生态紊乱、菌群丰度下降、细菌毒力改变等因素可破坏肠黏膜生物屏障，诱导IBD的发病。随着近年对细胞外miRNAs研究的增加，粪便miRNAs被认为参与IBD患者肠道菌群变化的调节，并与IBD病情活动度和疾病预后评估密切相关。

粪便miRNAs主要由肠黏上皮细胞分泌，可通过胞外囊泡(EV)形式(如微囊泡、外泌体等)和非EV形式释放[35]，肠道微生物可通过miRNAs调节宿主基因的表达[36]，反之，miRNAs可主动并有选择性地进入肠道细菌，影响细菌基因转录和增殖[35]。Ji等[37]的研究表明miR-1226、miR-515-5p可抑制大肠埃希菌(E.coli)和具核酸杆菌(Fn)增殖，并促进肠道分节丝状菌(SFB)的生长。而miR-148-3p、miR-27-3p表达与IBD患者肠道变形菌(Proteobacteria)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)数量升高密切相关[38]。MiR-21缺失小鼠肠道菌群中拟杆菌门(Bacteroidetes)减少，厚壁菌门(Firmicutes)、保护性梭状芽孢杆菌目(Clostridia)丰度升高，这种肠道菌群变化可在DSS诱导的结肠炎模型中发挥保护作用[39]。而布拉酵母菌可降低结肠炎小鼠肠道高表达的miR-155和miR-223，这一改变可使结肠炎小鼠肠道厚壁菌门与拟杆菌门比例恢复至健康小鼠水平[40]。综上所述，IBD患者粪便miRNAs表达异常可通过影响肠道微生物组成调节IBD发病的机制。

三、MiRNAs与IBD诊治新思路

1. MiRNAs与IBD的诊断：相比于传统的C反应蛋白(CRP)和内镜检查，miRNAs检验结果具有较高的特异性和敏感性，且用于临床检验更方便、经济，在IBD患者的诊断尤其是对于活动期患者病情严重程度评估中发挥重要的生物学标志物潜能。Chen等[41]的研究结果显示，外周血miR-146b-5p在UC和CD中分别升高2.72倍和2.87倍，而在肠结核和其他非IBD肠病(如缺血性肠炎、感染性肠炎、药物性肠炎等)中无明显升高。粪便miR-1246明显升高或可为IBD合并艰难梭菌感染(CDI)的诊断提供可靠证据[42]。

2. MiRNAs与IBD的治疗：在IBD治疗方面，miRNAs的模拟物和反义抑制物可纠正内源性miRNAs失调，已在动物实验中取得了不错的效果[43]。给予TNBS诱导的结肠炎小鼠反义miR-301a处理后，小鼠体质量、结肠长度、组织病理评分等改善程度优于对照组，且结肠组织CD4+T细胞、巨噬细胞浸润减少[3]。但某些miRNAs靶点较多、作用机制复杂且效应广泛，针对于miRNAs的IBD治疗是否能解决不良反应和安全性的问题仍值得进一步研究。

四、结语

综上所述，miRNAs可通过与促炎细胞因子相互影响，调节免疫细胞分化和分泌功能，还可影响肠黏膜屏障功能，并参与调节肠道共生菌群的构成和毒力。此外，部分miRNAs在IBD患者体内的表达具有较高的特异性和敏感性，可作为疾病诊断的生物学标志物，并有望在IBD的治疗中提供新的方法。