急性低氧诱导人肝癌细胞差异表达基因的筛选及其功能

路远，韦花媚，谭川，吴贤建，邵泽生，伍毅，许佐明，李文川，浦涧

1右江民族医学院附属医院·广西肝胆疾病临床研究中心,广西百色533000;2右江民族医学院

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的癌症之一，是癌症相关死亡的常见原因[1]。大部分HCC患者在就诊时已处于晚期[2]。HCC主要与乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染、饮酒或代谢综合征有关[3]。当机体对氧气的需求超过其供应时，全身或局部组织中的氧含量降低，称为低氧。如果机体不能适应低氧环境，会引起一系列病理生理反应。低氧时，组织的代谢、功能、形态结构都会发生变化，过度低氧将导致机体功能出现衰竭，神经系统、循环系统、呼吸系统等均会遭受不同程度的损伤，甚至导致脑、心、肺等重要器官死亡。同时，低氧与肿瘤进展密切相关[4]。肿瘤细胞新陈代谢旺盛，正常的组织供氧能力满足不了细胞的需求，且肿瘤内部新生血管紊乱，绝大部分实体瘤处于低氧环境[5]。低氧会诱导细胞周期停滞、细胞增殖、抑制凋亡、血管生成进而促进肿瘤细胞侵袭转移，对治疗产生耐受性，进而直接降低治疗效果。据报道，肿瘤转移导致了90%的肿瘤患者死亡[6]。人肝癌细胞株Huh-7、Hep3B对低氧尤为敏感，是研究低氧对肿瘤影响的理想细胞系。2018年4月～2019年4月，本研究建立低氧诱导的Huh-7、Hep3B细胞模型，采用基因芯片技术检测细胞中差异表达的基因，并分析其功能。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系Huh-7、Hep3B购于中国科学院干细胞库。DMEM、胎牛血清购于Gibco；青霉素、链霉素购于诺维赞公司；TRIzol购于Invitrogen公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司。Thermo NanoDrop 2000和Agilent 2100 Bioanalyzer购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，Gene Chip Clariom S Array芯片购自上海吉凯基因科技有限公司，RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，扫描仪(GeneChip Scanner 3000)购自美国昂飞公司。

1.2 细胞低氧诱导 将Huh-7、Hep3B细胞用DMEM添加10%胎牛血清置于37 ℃培养箱培养。培养至细胞融合度为70%时，随机取部分细胞置于常氧条件(空气、5% CO2)下培养，取部分细胞置于低氧条件(1% O2、5% CO2、94% N2)下培养，均培养20 h后收样。

1.3 差异表达基因筛选 当细胞培养至密度为80%时，使用TRIzol法按照细胞总RNA提取试剂盒操作说明，提取细胞总RNA。用Thermo NanoDrop ND 2000紫外分光光度计检测A260/A280值分别为2.04、2.01、2.07、1.97；用Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA的质量，RNA质量符合芯片质量要求。吸取First-Strand Master Mix 5 μL加入5 μL Total RNA/Poly-A Control Mixture 中，混匀，按照cDNA第一链程序孵育第一链，以第一链为模板进行cDNA第二链的合成。将IVT master mix 30 μL加入二链合成产物中，混匀，合成标记cRNA。同时完成cRNA生物素标记。再将纯化并定量的体外转录后的cRNA产物经高温高盐处理化成35～200 bp片段。片段化的cDNA通过末端脱氧核苷酸转移酶使用Affymetrix公司专有的DNA标记试剂共价连接至生物素。将片段化的cDNA与其他对照试剂混合，制备成杂交液，将杂交液注入芯片中，将芯片放入杂交炉，45 ℃ 60 r/s旋转孵育16 h后取出芯片，加入洗脱液和染色液，在全自动的洗脱染色工作站(Fluidics station 400)中完成洗脱和染色。用扫描仪(GeneChip Scanner 3000)进行芯片扫描，收取基因表达的荧光信号值，用内参基因对获得的原始信号进行均衡和校正。用Microarray suite software信号处理软件对扫描的图像进行数字化处理，计算荧光信号的强度和比值。

1.4 差异表达基因的功能分析 样品间差异统计使用错误发现率(FDR)与log2Fold Change(log2FC)，筛选条件为错误发现率(FDR)<0.05且|log2FC|>1。获得差异表达基因后，分别使用Kolmogorov-Smirnov和KOBAS version 2.0对差异表达基因进行基因本体论(GO)功能分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析。以Q-value≤0.05为阈值，满足此条件的功能聚类分享(GO term)和信号通路(Pathway)定义为在差异基因中显著富集的GO term和Pathway。

2 结果

2.1 差异表达基因的筛选结果 与常氧处理的细胞相比，急性低氧诱导的Huh-7细胞中差异表达≥1.5倍且FDR<0.05的基因共计392个，其中表达上调基因266个，表达下调基因126个；急性低氧诱导的Hep3B细胞中，低氧诱导差异表达≥1.5倍且FDR<0.05的基因共计2 260个，其中表达上调基因847个，表达下调基因1 413个。急性低氧诱导的Huh-7细胞与Hep3B细胞共同的差异表达基因共177个，表达上调的127个，表达下调的50个。

2.2 差异表达基因的GO功能 低氧诱导Huh-7细胞的差异表达基因GO功能分析：在生物学过程(BP)层面上主要介导小分子代谢、生物合成过程、细胞氧化应激过程；在分子功能(MF)层面上主要富集于酶结合、金属离子结合、激酶结合；在细胞组分层面上主要参与胞外间隙、细胞质膜组成、内质网的调控。低氧诱导Hep3B细胞的差异表达基因GO功能分析：在BP层面上主要介导小分子代谢、含磷复合物代谢、细胞周期过程；在MF层面上主要富集于核糖核酸结合、酶结合、核苷酸结合；在细胞组分层面上主要参与线粒体组分、细胞骨架、微管构成。

2.3 差异表达基因的KEGG功能 低氧诱导的人肝癌Huh-7细胞中共有2 052条差异表达基因比对到31条通路中。选取Q-Value从小到大排序前10的通路，分别为糖酵解途径、MAPK通路、细胞周期、癌症、类固醇合成、系统性红斑狼疮、戊糖磷酸途径、过氧化物增殖途径、Toll样受体通路。

低氧诱导的人肝癌Hep3B细胞中共有3 070条差异表达基因比对到31条通路中。选取Q-Value从小到大排序前10的通路，分别为细胞周期、亨廷顿舞蹈病、阿尔茨海默病、p53信号通路、氧化磷酸化作用、癌症、氨基酸降解、MAPK通络、帕金森病通路。

从Huh-7细胞与Hep3B细胞共同的差异表达基因中选择表达变化最大的5个基因TXNIP、ATF3、SLC6A8、TIPARP、PFKFB4，进行信息查询，结果显示TXNIP、ATF3、PFKFB4均与肝癌发生相关。TCGA数据分析显示，SLC6A8基因在肝癌组织中表达升高。

3 讨论

目前，关于癌症(肝癌、肺癌、前列腺癌、结直肠癌等)的转录组测序及其差异基因表达已有诸多报道[7，8]。通过转录组测序筛选出的差异表达基因，可能在癌症进展过程中发挥关键作用，并可作为癌症潜在的生物标记物和治疗靶点。

健康的组织可通过自我稳态调节来实现氧浓度的平衡，使组织内氧浓度维持在2.5%～9%[9]。当组织发生病变或炎症反应时，由于细菌和病原体代谢增强、血管损坏、炎症细胞浸润，大量消耗组织内的氧，使得组织含氧量低于1%，产生了低氧状态。低氧是重要的肿瘤微环境，恶性肿瘤组织内异常血管生成、血管灌注减少及肿瘤细胞无限制的生长，导致微环境中氧含量降低，这一现象在实体肿瘤中普遍存在。在低氧微环境中肿瘤会发生一系列的生物学变化，引起能量效率与控制细胞增殖的关系失调，从而促进肿瘤的快速生长[10]。而目前关于低氧对癌症基因表达的影响鲜有报道。为了揭示低氧对癌细胞基因表达的影响，本研究采用对低氧敏感的人肝癌细胞Huh-7、Hep3B探讨低氧诱导对癌细胞的影响，获得了不同数据库的测序数据，同时筛选相关差异表达基因。本研究中Huh-7、Hep3B细胞经低氧处理后，用基因芯片筛选得到多个差异表达的基因。这些表达差异的基因可能参与了低氧环境下肝癌的发生发展。

研究表明，低氧微环境主要受低氧诱导因子1α(HIF-1α)调控，而HIF-1α在多种癌症中高表达，参与癌细胞的生长、迁移、血管生成和细胞凋亡。HIF-1α能促进也能抑制细胞增殖[11]，同时有研究发现，低氧抑制成骨细胞增殖的同时也促进其凋亡[12]，而长期低氧则抑制牙周膜细胞增殖[13]。低氧胁迫能改变斑马鱼和鲢鱼心脏、肝脏等器官中的周期相关蛋白的表达；差异表达基因主要通过降低细胞周期蛋白D1(CyclinD1)-周期蛋白依赖性激酶复合物将细胞周期阻滞在G1/S和S/G2期[14]。低氧通过上调影响肝癌细胞周期的生长因子如CyclinD1、转化生长因子、胰岛素样生长因子2的表达，促进肝癌细胞的增殖分化，完成细胞周期进程[15]。本研究发现，KEGG通路富集显示低氧诱导Huh-7、Hep3B细胞中差异表达基因参与细胞周期的调控，这与以上研究结论一致。

低氧可激活许多复杂的细胞内信号通路。在低氧环境下趋化因子、细胞因子和依附在G蛋白偶联受体、酪氨酸激酶受体、Toll样受体(TLR)的生长因子可激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B、核因子κB、丝裂原活化蛋白激酶信号通路。TLR是固有免疫中关键的模式识别受体，不仅介导了免疫系统的激活和细胞凋亡，与肿瘤的生长侵袭也密切相关[16]。肿瘤细胞上的部分TLR可通过炎症反应依赖或非依赖地促进肿瘤生长，如TLR2和TLR4通过诱导炎症的发生形成肿瘤炎症微环境，促进肿瘤的发生。TLR的激动剂已被证实具有强烈的抗肿瘤活性，可以刺激耐药宿主细胞的免疫系统，进而杀死或损伤肿瘤细胞[17]。MAPK信号通路调节CyclinD1和p27的表达，从而影响细胞周期G1至S期的进程。MAPK信号通路还对许多转录因子(CREB、c-Fos、c-Jun、Elk-1)有调控作用，并通过调控下游转录因子的磷酸化来发挥功能[1]。本研究发现，低氧诱导Huh-7细胞的差异基因富集在TLR信号通路，表明低氧可能在肝癌细胞中引起炎症反应。低氧诱导的Huh-7和Hep3B差异表达基因均涉及MAPK通路，这与低氧可引起细胞周期相关基因表达改变的结果相符。

60%的慢性和急性实体肿瘤中存在低氧现象[18]，因此低氧已经成为侵袭性肿瘤的一种病理现象。癌细胞的平均含氧量低于4.4%，在某些聚焦区域可能为0[19]。这主要是由于供需之间的不平衡，肿瘤细胞异常快速增殖需要消耗大量氧气，超过正常的组织供氧。低氧微环境的形成也可能是由于肿瘤细胞中血管网络运输效率低或者血红蛋白含氧量低造成的。持续的低氧会改变肿瘤的几何形状，获得上皮-间充质转化的表型，从而增强癌细胞的转移侵袭能力，助其扩散至身体的其他部位，促进肿瘤的恶性进展。此外，氧气供应不足会改变癌细胞的新陈代谢，并导致肿瘤的表型多样性。低氧还可以限制治疗药物灌注，从而导致肿瘤化学、生物、放射和热治疗的耐受性[18]。本研究发现，低氧诱导Huh-7和Hep3B细胞表达变化显著的基因TXNIP、ATF3、PFKFB4均与肝癌发生相关。证实低氧与癌症的发展密切相关。

本研究仅选择两株肝癌细胞进行低氧诱导，筛选差异表达基因，将来应采用更多的肝癌细胞对该结论进行验证。另外本研究仅从细胞层面探讨低氧对肿瘤发生的作用，研究比较局限，应进一步从动物实验及临床进行探讨。