噻虫啉治疗继发性泡型包虫病的实验研究

刘川川, 马 兰, 格日力, 樊海宁

泡型包虫病(Alveolarechinococcosis,AE)是多房棘球绦虫的幼虫多房棘球蚴(E.multilocularis)寄生于人体所致的一种罕见人兽共患寄生虫病，表现为恶性肿瘤的生长方式并可通过血液循环扩展到肺、脑、肾等远处器官[1-2]，该疾病主要流行于北半球[3-4]。近年来，中国西北地区的发病率有所上升，尤其在青海省，其发病率已达到0.63%[5]。该病起病隐匿，且病情发展缓慢，一旦发现患者多处于疾病晚期并出现了较为明显的并发症状，如腹痛、黄疸、消瘦甚至肝功能衰竭[6]。许多患者因发现较晚而失去了治疗的机会。若患者不行相关治疗，70%患者在5年内死亡，90%患者在确诊后10年内死亡[7]。包虫病的治疗以外科手术治疗为主[8]，但药物化疗作为包虫病的辅助治疗手段，术前用于缩小病灶和抑制虫体活性，术后用于预防包虫病的复发，仅仅抑制了寄生虫肉芽肿的进展但并不能治愈这种疾病，这意味着患者必须在长时间内接受化疗，从而造成治疗高成本和药物副作用的风险。因而，寻找治疗包虫病更为有效药物或先导化合物是必要的。

噻虫啉(Thiacloprid, Thia)是由尼古丁经过改造开发出的新烟碱类杀虫剂，作为一种系统性杀虫剂，用于保护作物免受穿透性吸食昆虫的侵害，并用于控制猫、狗等动物的体表寄生虫[9-11]。噻虫啉对哺乳动物来说几乎没有风险[12]。噻虫啉的杀虫活性主要来源于其对昆虫突触后烟碱乙酰胆碱受体(nAchRs)的激动作用，引起乙酰胆碱的累积，导致昆虫的麻痹和死亡[10]。噻虫啉对人类和哺乳动物毒性较低，与脊椎动物的nAchRs作用较弱，而且不容易穿透血脑屏障[10,13]，不会在动物组织中积聚[14]。目前已鉴定出多种多房棘球绦虫nAchRs[15]，但对其功能均未进一步研究。鉴于噻虫啉对有害昆虫以及体表寄生虫表现出的良好杀伤作用，本研究拟初步探讨噻虫啉是否能杀伤多房棘球绦虫原头节进而开发成为抗包虫病先导化合物的潜能。

1 材料与方法

1.1实验动物和虫体来源 SPF级Balb/c小鼠(雄性, 18～20 g)购自南京青龙山动物饲养基地(合格证号：No.201901649)，并饲养于本实验室SPF级动物房中。多房棘球绦虫原头节来源于本实验室在沙鼠体内保种。

1.2主要试剂与仪器 噻虫啉、阿苯达唑和阿苯达唑亚砜均购自美国Sigma公司，0.25%胰蛋白酶、青链霉素混合液(PS, 100×)、HE染色试剂盒均购自北京索莱宝公司，RPMI 1640培养基、DMEM培养基购自武汉普诺赛公司，胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司，CCK-8试剂盒购自日本东仁公司。光学显微镜为日本Olympus产品，全波长酶标仪为瑞士Tecan产品，全自动生化分析仪为日本HITACHI产品。

1.3多房棘球蚴原头节分离及体外培养 由蒙古长爪沙鼠体内分离保种的多房棘球蚴原头节。沙鼠麻醉后于生物安全柜内无菌取出腹腔中泡型包虫囊肿。将包虫囊肿置于PBS液中剪碎，通过4层无菌纱布过滤原头节至50 mL无菌离心管。先经100目尼龙网过滤原头节，后使用40 μm细胞筛过滤除去钙质小体。原头节自然沉降后，加入含有10%灭活FBS、1%PS RPMI1640完全培养基，置于37 ℃ 5% CO2条件下培养，每3～4 d PBS清洗并更换培养基1次。部分原头节用于感染Balb/c小鼠构建继发性包虫病感染模型。

1.4噻虫啉对多房棘球蚴原头节的体外作用 将培养原头节经PBS洗涤后，用含有10%FBS、1%PS RPMI1640完全培养基重悬，使每毫升培养基中含有约200个原头节。将约2 000个原头节加入6孔细胞培养板中，并加入终浓度为10、20、40、80、120 μg/mL噻虫啉，以10 μg/mL ABZso为阳性对照组(ABZso组)，以0.2% DMSO作为阴对照组(DMSO组)。37 ℃ 5% CO2条件下连续培养6 d，每日用0.1%伊红染色原头节随机评估100个原头节中存活原头节数目，用100×放大倍数的正置显微镜上观察。原头节经0.25%戊二醛固定后用于扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察。

1.5SEM和TEM观察 电镜观察噻虫啉处理后原头节微观结构的改变。体外经噻虫啉处理第6 d原头节，经2.5%戊二醛在4 ℃下避光固定24 h，然后用2% OsO4后固定2 h。随后样品在双蒸水中洗涤，1%醋酸铀处理30 min。再次经双蒸水清洗后，在乙醇中连续梯度(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)脱水各10 min。进行扫描电镜分析，将脱水后样品浸入六甲基二硅氮烷中，在通风橱中风干，样品喷金后于扫描电子显微镜(Hitachi, SU8100)下观察。进行透射电镜分析时，将脱水后样品先后经过脱水剂和环氧树脂渗透液，在65 ℃聚合过夜。制备50 nm的超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色，使用透射电镜(JEOL, JEM-1400PLUS)进行观察。

1.6噻虫啉对多房棘球蚴原头节的体内作用 分离原头节经无双抗PBS冲洗8～10次后用生理盐水重悬，计数后以2 500个原头节悬浮于0.3 mL生理盐水腹腔注射感染Balb/c小鼠，另以0.3 mL生理盐水注射10只小鼠作为空白对照组。感染后3月将感染成功包虫小鼠随机分为3组(10只/组)：模型组，每日给予PBS/蜂蜜(1∶1)0.4 mL灌胃；ABZ组，每日给予阿苯达唑(100 mg/kg)PBS/蜂蜜(1∶1)0.4 mL灌胃；Thia组，每日给予噻虫啉(20 mg/kg)PBS/蜂蜜(1∶1)0.4 mL灌胃。空白对照组给予PBS/蜂蜜(1∶1)每日灌胃。灌胃4 w后，仔细剖检取出腹腔中包虫囊肿和脾脏并称量，脾脏指数=[脾脏重量/(小鼠体重-包虫囊肿重量)]×10，抑囊率(%)=[(模型组小鼠囊重-实验组小鼠囊重)/模型组小鼠囊重]×100%；部分囊肿组织经4%多聚甲醛固定，用于组织病理学实验。

1.7噻虫啉体外毒性评价 以LO2细胞、HepG2细胞评估噻虫啉的细胞毒性。在96孔板细胞培养板中加入180 μL细胞悬液，密度均为1×104/孔。细胞经饥饿处理24 h后，加入终浓度为10、20、40、80、120 μg/mL噻虫啉，并以0.2% DMSO作为空白对照。经噻虫啉处理48 h后，去除各孔培养基，每孔加入90 μL培养基和10 μL CCK-8溶液。继续培养1 h后，用酶标仪读取在490 nm处的吸光度值，并计算细胞抑制率。

1.8噻虫啉体内毒性评价 以未感染的雄性Balb/c小鼠评价噻虫啉毒性。Balb/c小鼠分为两组(每组6只)：对照组和Thia组(20 mg/kg)，灌胃方式和剂量同前述。小鼠经灌胃处理4 w，麻醉后经眼球取血，分离血清使用全自动生化分析仪检测肝、肾功能指标。取自小鼠的肝、肾组织经4%多聚甲醛固定后，包埋于石蜡中，制成厚度为5 μm切片，行HE染色观察肝、肾损伤情况。

2 结 果

2.1噻虫啉对多房棘球蚴原头节作用效果 体外评价噻虫啉对多房棘球蚴原头节的杀伤作用，结果显示：原头节经0.2% DMSO作用6 d后其活性率仍然较高(92.33±2.08)%，并且其形态和活动度未见明显改变；不同浓度噻虫啉作用后原头节存活率如图1，原头节经40 μg/mL及以上浓度噻虫啉作用6 d后原头节存活率小于35%，死亡原头节体积明显变小，同时出现体壁收缩。而药物浓度低于20 μg/mL时，对原头节的活性无明显影响(图2)。

图1 不同浓度噻虫啉对多房棘球蚴原头节存活的影响

图2 噻虫啉作用6d对多房棘球蚴原头节形态的影响(黑色箭头示存活原头节，红色箭头示死亡原头节)

2.2噻虫啉对原头节微观结构的影响 图3显示40 μg/mL噻虫啉处理6 d后扫描电镜和透射电镜观察细微结构改变结果。扫描电镜观察结果显示，未经药物处理原头节未发生超微结构的改变，经过噻虫啉处理后原头节体表微绒毛结构破坏，体壁明显收缩，头钩脱落。透射电镜结果显示，正常多房棘球蚴原头节被膜层表面突出许多微绒毛，被膜下细胞有较大的细胞核和核仁，细胞和细胞器结构可辨识；40 μg/mL噻虫啉处理后原头节微绒毛消失，被膜下细胞结构破坏，内部结构不可辨识。

图3 噻虫啉对多房棘球蚴原头节微观结构的影响

2.3噻虫啉对多房棘球蚴的体内效果 通过体内实验研究噻虫啉对多房棘球蚴效果，通过测定小鼠感染原头节后囊肿重量来确定体内疗效。经噻虫啉和阿苯达唑干预后每只小鼠病灶均表现出多囊性生长，代表性囊肿如图4所示。未治疗组囊肿表面可见丰富的血管，囊泡呈葡萄串样生长。与空白对照组相比，模型组、ABZ组、Thia组脾脏指数均增加，差异有统计学意义(F=61.20,P<0.05)；与模型组相比，ABZ组、Thia组脾脏指数均增加，差异有统计学意义(q=5.206、10.87，P<0.05)。包虫囊肿湿重结果显示，与模型组相比，Thia组囊肿重量(3.66±0.65)g和阿苯达唑组囊肿重量(5.06±1.54)g明显低于模型组组囊肿重量(10.92±2.15)g(F=41.50,P<0.05)，Thia组囊肿重量与阿苯达唑组囊肿重量之间无差异(q=2.261,P>0.05)(表1)。

图4 噻虫啉治疗后包虫囊肿大体形态

表1 噻虫啉对包虫囊肿湿重的影响

2.4噻虫啉对包虫囊肿形态的影响 图5显示了HE染色包虫囊肿的显微组织结构。各组病灶的中心均表现为干酪样坏死。模型组囊壁能观察到明显连续的生发层、角皮层、外膜层以及存活的原头节，并且在角皮层和外膜层之间有清晰的边界；而经噻虫啉处理观察到空泡化的层压层，未观察到明显的生发层。在ABZ组仍能观察到完整的囊壁结构及存活的原头节。

图5 噻虫啉治疗后包虫囊肿HE染色观察

2.5噻虫啉体内外毒性评价 药物副作用往往限制其临床应用，因此从细胞和整体水平研究了噻虫啉的毒性。体外采用细胞活性检测试剂盒(CCK-8)初步评价噻虫啉的细胞毒性，正常LO2细胞和HepG2细胞与80 μg/mL以下噻虫啉共孵育48 h后，细胞存活率均高于95%(图6)。

图6 噻虫啉对LO2细胞和HepG2细胞的抑制作用

通过形态学观察和血清肝肾功能测定评价噻虫啉的体内毒性。HE染色结果显示，经噻虫啉灌胃处理后，小鼠的肝脏、肾脏均没有组织损伤、细胞肿胀、免疫细胞浸润，无明显的病理学改变(图7)。与对照组相比，噻虫啉处理后小鼠肝肾功能指标无明显变化(表2)。

表2 噻虫啉对小鼠肝肾功能的影响

图7 噻虫啉对小鼠肝肾形态的影响(200×)

3 讨 论

包虫病仍然是世界性的重大公共卫生问题之一，严重影响牧区人群健康，给畜牧业造成了巨大的社会问题和经济损失[16]。药物治疗在泡型包虫病手术前后的作用是不可替代的。包虫病目前药物治疗主要依靠阿苯达唑，但由于需长期服用而出现耐药性、明显副作用且疾病复发率高等问题，限制了其在治疗中的应用[17-18]。由于这些原因，因而需要寻找治疗包虫病的有效药物或先导化合物。本研究发现，噻虫啉在体外能杀伤多房棘球蚴原头节，在继发性小鼠感染模型中也表现出良好的抗多房棘球蚴作用。此外，噻虫啉未表现出明显的细胞毒性和肝肾毒性。

噻虫啉作用于原头节后，40 μg/mL噻虫啉即可引起多房棘球蚴原头节死亡。噻虫啉干预后原头节头钩脱落、体表收缩，内部结构紊乱、生发层细胞明显破坏，原头节体表微绒毛脱落或消失，这与吡喹酮作用后表现出的变化相同[19]。噻虫啉灌胃治疗后棘球蚴囊肿重量较模型组明显减低，但与ABZ组之间无差异，说明噻虫啉在体内对多房棘球蚴病有一定的治疗作用。人是多房棘球绦虫非适宜的中间宿主，病灶内原头节几乎没有，这表明阿苯达唑代谢产物还可能通过影响包虫-宿主界面微环境限制病灶的外生性生长。因此，噻虫啉也可能通过抑制包虫-宿主界面微环境发挥抗包虫病作用。组织病理学检查显示，噻虫啉作用后生发层明显破坏，仅表现为大量空泡状结构，表明噻虫啉对包虫病囊肿组织有直接的破坏作用，从而抑制囊泡生长，发挥抗多房棘球蚴病的作用。

包虫-宿主界面微环境类似于肿瘤微环境[20]，但表现为感染性肉芽肿反应[21-23]，包虫-宿主界面微环境是感染性肉芽肿中最关键部分。寄生虫刺激下通过各种生长因子和细胞因子募集成纤维细胞及多种免疫细胞，与寄生虫相互作用，支持寄生虫的生长、存活和转移。噻虫啉作用后引起小鼠脾脏指数增加，表明噻虫啉可能对包虫感染后小鼠的免疫系统有刺激作用，但本研究未进一步探讨其对免疫细胞及相关细胞因子的影响。但免疫应答的激活被认为参与抗多房棘球蚴感染[24]。

噻虫啉与烟碱相比优势在于其较低的毒性[10]。事实上，噻虫啉广泛应用于控制猫、狗的体表寄生虫[11]。体外CCK-8试验结果表明80 μg/mL以下噻虫啉没有明显的肝细胞毒性作用。此外，40 mg/kg以下噻虫啉对肝、肾组织形态和血清肝肾功能指标无影响，证实了噻虫啉的低毒作用。虽说噻虫啉毒性低，但高剂量的噻虫啉对骨髓红细胞和染色体仍存在一定的影响[25]。

本研究证实了噻虫啉在体内外均能发挥抗多房棘球蚴的作用，能提高包虫感染小鼠的免疫能力，且没有明显的肝肾毒性。因此，噻虫啉有成为开发抗包虫病先导化合物的可能，但噻虫啉是否作用于多房棘球绦虫nAchRs以及对包虫-宿主界面微环境调节的具体机制还有待进一步研究。

利益冲突：无