佐剂在水产疫苗中的研究进展

■徐晓丽 徐林通 郑艳坤 任涵玮 宋昀鹏 李 灏

(天津市水产研究所，天津300221)

随着规模化、高密度、集约化的现代水产养殖模式的快速发展，病害问题也接踵而至，2019 年我国水产养殖因病害造成的经济损失约408亿元[1]。而病害控制过程中的药物滥用，不仅达不到预期效果，导致不可估量的经济损失，还会引起病原耐药性产生，影响水产品质量安全，也给生态环境带来一系列问题，严重制约着水产行业的发展。对水产养殖动物疾病的防控有三条途径，一是生态防控，通过采用各种生态养殖模式和技术措施，如多营养层次养殖技术模式，降低养殖密度，通过食物链减少疾病传播、避免病害发生；二是药物防控，主要通过消毒剂定期对池水、食台等进行消毒，减少水体中病原菌数量，采用微生态制剂产品，降低水体氨氮、亚硝酸盐氮等，降解水体有机质，促进水体菌藻平衡，同时在动物饲料中添加免疫增强剂（如多糖类物质），提高养殖动物自身抗逆性，避免疾病发生；三是免疫预防，即对养殖动物接种疫苗，使其体内产生对所接种疫苗的特异性免疫应答，增强机体抗应激的能力，提高免疫保护能力。其中免疫预防是一种相对安全有效、经济、环境友好、极具发展前途的水产疾病控制方式。

水产领域现有针对20多种水产病原的100多种鱼类疫苗经批准上市，主要为减毒活疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗等，其中减毒活疫苗出于安全原因，在许多国家未获准应用于水产养殖；灭活疫苗、亚单位疫苗等高度纯化的疫苗成分通常缺乏病原相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMP），不能有效激活先天免疫应答而发生有效的适应性免疫反应，从而造成对某些病原尤其是细胞内病原的免疫保护效果不佳[2]。佐剂是一组能够调节抗原固有免疫原性的结构异质化合物，并不引起机体产生免疫应答，可像PAMP一样发挥作用，触发先天性免疫应答，将疫苗组分识别为“威胁”，伴随抗原呈递细胞的激活和成熟，启动适应性免疫反应，加强特异性免疫应答强度，延迟免疫保护持续时间，减少疫苗副作用[2-3]。理想的佐剂能够提高疫苗的有效性，无副作用，易于获取及普遍应用。近年来，疫苗佐剂的研究也引起越来越多的重视，新型疫苗佐剂要针对疫苗类型、作用方式及载体、免疫效率、免疫效果持久性以及佐剂本身毒性等方面进行研究，以更好地配伍疫苗，提高免疫保护效果[4]。

在鱼类疫苗学中，含油佐剂应用最为广泛，几乎所有鲑鱼都注射油佐剂疫苗。其他如β-葡聚糖、壳聚糖、白介素、鞭毛蛋白等也可用作佐剂，其中β-葡聚糖是鱼口服疫苗中目前使用最好的佐剂[5-6]。根据疫苗佐剂在免疫应答中的作用，可将其分为两类，信号1促进剂和信号2促进剂。前者在时间、位置和浓度上影响机体免疫应答，最终提高其免疫效率，如油佐剂、纳米/微米颗粒佐剂等；后者在抗原识别过程中提供共刺激信号，为抗原提供适当的反应环境，从而提高免疫效能，如铝佐剂、Toll样受体（TLR）配体等分子佐剂等。抗原（信号1）和附加次级信号（信号2）的呈递都是激活特异性T和B淋巴细胞所必需的，从而形成免疫系统的适应性免疫[7]。

1 信号1促进剂

1.1 油佐剂

油佐剂由矿物油、乳化剂和稳定剂混合而成。鱼类疫苗主要用油包水乳剂，抗原在佐剂的作用下缓慢释放，由此诱导高效且持久免疫保护作用。Erkinharju等[8]比较了植物油及矿物油作为多联疫苗佐剂对海参斑(Cyclopterus lumpus L.)的副作用，认为腹腔注射含矿物油佐剂疫苗引起的副作用相对较小，同时又可刺激鱼体产生显著高于对照组的免疫反应。油佐剂中弗氏完全佐剂（FCA）应用最为广泛，注射后佐剂在动物体内作为呈递抗原的载体和贮存库，使抗原缓慢释放，通过MyD88 途径持续刺激动物产生强烈的Th1 和Th17反应，产生较高的免疫力[9]。但使用FCA也有一定的副作用，如不易注射，注射部位的肉芽肿等。Zhang等[10]在五价疫苗中分别使用黄芪多糖、蜂胶和FCA作为佐剂，结果显示FCA诱导的免疫刺激活性效果优于黄芪多糖和蜂胶。但不是所有疫苗使用FCA均可提高免疫原性，如福尔马林灭活的海豚链球菌(Streptococcus iniae)疫苗本身可为虹鳟(Oncorhynchus mykiss)提供良好的保护，加入FCA后这种保护作用并未显著增强[11]。由于FCA对受免动物的副作用，逐渐被去除分枝杆菌成分的弗氏不完全佐剂（FIA）取代，毒性明显降低。对虹鳟乳球菌病的疫苗研究发现，福尔马林灭活的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)菌苗及混合FIA的菌苗分别腹腔注射免疫虹鳟，125 d后的感染实验发现，无佐剂组的相对存活率（RPS）为54%，而FIA组的RPS提高到85%[12]。

为提高疫苗制剂的功效和稳定性，减少副作用，以Montanide商标注册的优化矿物油佐剂上市。这类佐剂使用甘露醇油酸酯作为特定表面活性剂，可用于生产不同类型的用于哺乳动物和鱼类的乳剂[7]。Hwang 等[13]在褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)病毒性出血性败血症（Viral hemorrhagic septicemia，VHS）浸泡疫苗的研究中发现，以Montanide IMS 1312 VG 作为疫苗佐剂与热灭活的VHS 病毒FP-VHS2010-1 菌株（VHSV），健康鱼在（20±2）℃下浸泡接种5 min，可增强免疫相关基因（IL-1β、IL-6、IL-8和TLR3）的表达，提高鱼类的RPS。此外，Montanide ISA-763也被用作格氏乳球菌和嗜水气单胞菌二联疫苗的佐剂，对虹鳟鱼具有很好的免疫保护力[14]。

1.2 纳米/微米粒子佐剂

微粒作为疫苗递送载体得到研究人员的广泛关注，抗原与微粒以共价结合或物理包埋结合在一起，所需的抗原量更少，抗原呈递效率更高，低剂量的抗原即可刺激机体产生最佳的体液免疫反应，存储更稳定，材料易回收。微米聚合物颗粒被认为是哺乳动物系统中的最具潜力的佐剂[15]。

PLGA[poly-(D,L-lactic-co-glycolic)-acid]纳米/微米粒子具有良好的生物相容性和可降解性，其作为疫苗抗原载体的研究已经进行了20 多年。PLGA 颗粒可封装一种或多种抗原，抗原通过基质孔扩散及基质降解而从微球中释放出来，提高了抗原释放的可预测性。生物降解速率可以通过改变聚合物组成和分子量来调节。另外，表面相关抗原的即时持续释放可能有助于快速反应及介导长期的免疫保护[16-17]。Hølvold等[17]研究了纳米级（320 nm）和微米级（4 μm）PLGA颗粒肌肉注射接种鱼体后引起的免疫反应。将编码荧光素酶（Photinus pyralis）基因的质粒载体分别封装在两种不同大小的PLGA 颗粒中，肌内注射大西洋鲑(Salmo salar)，分析肌肉、头肾和脾多种细胞因子的转录水平，结果显示两种大小的PLGA 颗粒都能在注射部位诱导促炎性免疫反应，微米级PLGA 颗粒与油佐剂炎性病理变化相近，而纳米级PLGA 颗粒在鱼体内分布类似于裸pDNA的分布，同时鱼体中抗病毒基因的表达明显上调，这为病毒DNA疫苗的研究提供了参考和依据。PLGA封装疫苗也可通过浸浴对鱼进行免疫，能够显著上调IgM、IgT、pIgR、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ、IFN-γ 和Caspase3 等免疫相关基因的表达，说明PLGA载体可有效保护灭活的病毒抗原并将其运输至免疫器官，刺激鱼体产生保护性免疫应答[18]。

2 信号2促进剂

2.1 铝佐剂

磷酸铝和氢氧化铝是少数可用于人类疫苗的佐剂。铝佐剂几乎仅诱导Th2反应，对促进体液免疫特别有效。明矾也是铝佐剂的一种，作为一种晶体，能够强力结合树突状细胞质膜脂质，独立于炎症小体和膜蛋白，随后的脂质分选激活了导致抗原摄取的无效吞噬反应。这种活化的树突状细胞不与明矾进一步结合，而是通过细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和淋巴细胞功能相关抗原-1（LFA-1）表现出高亲和力和与CD4+T细胞的稳定结合[19]。铝佐剂在用于鱼类疫苗的研究较少，Hoare 等[20]研究了角鲨烯/氢氧化铝作为佐剂的嗜冷黄杆菌（Flavobacterium psychrophilum）灭活疫苗，免疫大西洋鲑进行攻毒，可显著提高受免鱼的RPS，且角鲨烯/铝佐剂比传统的油佐剂安全，更易被鱼体代谢，引起的组织炎性反应较轻。

2.2 β-葡聚糖，dectin-1的配体

葡聚糖作为一种免疫增强剂，广泛应用于水产动物免疫中，主要是β-1,3-D-葡聚糖，可通过刺激dectin-1参与的哺乳动物和鱼类非特异性免疫反应，显著提高鱼体细胞免疫应答和体液免疫应答[21-22]。在鲤鱼嗜水气单胞菌疫苗的研究中发现，在免疫接种之前提前腹腔注射β-葡聚糖，可显著提高鱼体内白细胞数量，刺激巨噬细胞产生超氧阴离子，同时诱导鱼体产生更高的抗体效价，有助于迅速杀灭病原体，而免疫前浸浴或口服β-葡聚糖并不能增强免疫反应[23]。作为一种可溶性佐剂，β-葡聚糖在浸浴免疫中也显示出较好的效果。一项针对虹鳟鱼的研究结果显示，疫苗中添加β-葡聚糖可显著上调虹鳟鳃细胞中黏膜免疫相关基因[24]。

2.3 皂苷

皂苷是类固醇或三萜的天然糖苷，能够刺激Th1和Th2反应，已广泛用于不同哺乳动物的佐剂中。使用最广泛的皂苷是Quil-A (ISCOM成分)及其衍生物，但是由于其高细胞毒性和在水相中的不稳定性，人们正在探索使用不同皂苷[25]。皂苷在鱼用疫苗中尚未有更为深入的研究。

2.4 分子佐剂

分子佐剂是信号2促进剂，包括相当数量的TLR和多种细胞因子等。与哺乳动物相比，硬骨鱼类的TLR数量可能是哺乳动物的近两倍。通常，那些在配体结合后诱导IL-12 产生的TLR 倾向于Th1 反应（TLR 3、4、5、7、8、9 和11），此外，这些TLR 的激活可能会诱导抗原交叉呈递，在某些条件下促进细胞毒性T 细胞应答，与TLR 3、4、7 和9 结合的配体也可能通过干扰素调节因子诱导Ⅰ型IFN反应[26-28]。

2.4.1 Poly I：C，TLR3激动剂

聚肌苷酸聚胞苷酸（Poly I：C）是一种双链多核糖核苷酸，能够模仿病毒感染，因此被广泛用于包括鱼类在内的多个物种中诱导I型干扰素（IFN），也是一种免疫增强剂[27，29]。IFN 在病毒感染的早期防御中起主要作用，Poly I：C 与TLR3 结合，随后激活细胞内信号传导后，诱导非特异性抗病毒状态产生。Chang 等[30]构建传染性鲑鱼贫血病毒（ISAV）血凝素酯酶（HE）基因作为抗原的DNA 疫苗，以编码I 类大西洋鲑鱼IFN（IFNa1、IFNb 或IFNc）的质粒作为佐剂免疫大西洋鲑，结果显示，三种IFN 质粒均可有效提高鲑鱼对ISAV 的免疫保护，并刺激了针对该病毒的抗体水平的提高。Kim 等[31]对褐牙鲆病毒性出血性败血病（VHS）疫苗的研究发现，预先注射了Poly I：C 可显著提高疫苗的保护效果及相对存活率，活疫苗比福尔马林灭活疫苗可提供更好的保护作用。Thim等[32]以Salmonid alphavirus (SAV)为抗原，分别以两种TLR配体、CpG 基序和Poly I：C 及表达VHSV 糖蛋白的DNA 质粒载体作为佐剂，免疫大西洋鲑，结果显示CpG/ Poly I：C 能够同时提高鱼体先天性免疫和适应性免疫，可作为病毒类疫苗佐剂的研究方向之一。

2.4.2 鞭毛蛋白-TLR5激动剂

鞭毛蛋白为革兰氏阴性菌鞭毛的结构蛋白。鞭毛蛋白是先天性和适应性免疫系统内多种类型细胞的有效激活剂。研究证明鞭毛蛋白通过TLR5信号传导诱导Th1 和Th2 的免疫反应，能够促进细胞因子产生[33]。Jiao 等[34]在研究褐牙鲆迟缓爱德华氏菌疫苗组成中发现，最有前景的疫苗为一种编码E. tarda Eta6蛋白融合该菌鞭毛蛋白Flic 框架的嵌合体DNA 疫苗。虽然迟缓爱德华氏菌鞭毛蛋白Flic 本身诱导较低的免疫保护，但可作为分子佐剂增强由E. tarda Eta6 诱导的特异性免疫应答，产生特异性抗体，刺激先天性和适应性免疫反应相关基因的表达（IL-1β、IFN、Mx、CD8α、MHC-Ⅰα、MHC-Ⅱα、IgM)[35]。张华[36]以大菱鲆为研究对象，筛选了13 种不同的迟缓爱德华氏菌灭活疫苗佐剂，其中以鞭毛蛋白FlgD 为佐剂的疫苗组获得良好的免疫保护效果，相对免疫保护率达到70%，鱼体内抗体水平在免疫第3 周达到最大值，免疫相关基因如MHC-I、IgM、IL-1β、TCR 和TNFα等均上调表达。

2.4.3 CpG-TLR9激动剂

CpG基序是指由非甲基化的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷酸组成的具有免疫调节作用的一段寡核苷酸序列，与合成寡脱氧核苷酸（ODN）可触发免疫刺激级联反应，诱导分泌多种细胞因子，诱导多种免疫细胞（如B和T淋巴细胞、NK 细胞、单核细胞、巨噬细胞及树突状细胞）的成熟、分化和增殖，还可诱导细胞凋亡。因此，CpG-DNA 序列具有免疫佐剂特性，可辅助刺激机体产生特异性及非特异性免疫应答，增强疫苗的免疫原性[7]。CpG基序在哺乳动物中比在微生物DNA中约低20 倍，被表达TLR9 的细胞识别为危险信号，CpGODNs用作佐剂能够加速和增强免疫反应[37-38]。在鱼类中，已经对CpGs的免疫调节作用进行了许多研究，但将其作为佐剂的研究较少。Liu等[39-40]研究了CpG基序对大菱鲆和褐牙鲆的保护作用，合成了16 个CpGODN，检测了其在褐牙鲆血液中抑菌能力，选择四个抑菌作用最强的ODNs，构建质粒pCN6，肌肉注射褐牙鲆4周后用嗜水气单胞菌进行感染实验，20 d后统计死亡率，结果显示重组质粒组死亡率（30%）明显低于空质粒组（66.7%）和PBS对照组（63.3%）；以迟缓爱德华氏菌进行的感染实验结果显示，重组质粒组死亡率为53.3%，空质粒组死亡率为90%，PBS对照组死亡率为93.3%。pCN6质粒提供了针对嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌的非特异性免疫保护，这种免疫保护也可对抗寄生虫及病毒的感染。另有研究发现含有CpG 和Poly I：C联合作为佐剂的SAV疫苗可诱导鱼体大量中和抗体的产生，SAV阳性鱼的比例明显减少[41]。

2.4.4 细胞因子

目前，人类已经识别并测序了鱼类的许多细胞因子基因，但很少有关于细胞因子作为鱼类疫苗佐剂的研究，对许多细胞因子的免疫调节机制仍不明确。白细胞介素8（IL-8）是一种CXC 趋化因子，哺乳动物的多种类型细胞（如巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞、嗜中性粒细胞和成纤维细胞）在病原感染后、IL-1β或TNFα刺激后均可产生IL-8。在哺乳动物中，趋化因子已被广泛用作病毒疫苗的佐剂，因为它们不仅吸引更多的细胞参与炎症反应，还调节细胞的免疫功能[7]。在鱼类中，虹鳟IL-8 的特征是其化学引诱特性，将编码VHSV糖蛋白基因的质粒疫苗与编码虹鳟IL-8的质粒共同注射，发现脾脏及接种处IL-1β明显增加，单独注射IL-8 可刺激脾脏中TNF-α、IL-11、TGF-β和IL-18的明显高表达。进一步研究发现，IL-8用作佐剂时，也可调节其他趋化因子如CK6、CK5B、CK7和CK5A的表达，表明IL-8能够调节鱼类早期抗病毒免疫反应，可能是有效的疫苗佐剂[42]。纳米结构的TNFα蛋白（IBsTNFα）也可能为鱼类潜在的黏膜佐剂，可经肠黏膜吸收进入肌肉层，上调斑马鱼肠道和脾脏的促炎细胞因子IL-6、IL-1β、IL-10及炎症调节细胞因子mmp9、Cox2，保护鱼类免受海分枝杆菌的感染[43]。

3 中草药佐剂

许多中药(蜂胶、人参、当归及芦荟等)的主要活性成分为多糖，常见的如黄芪多糖、枸杞多糖、香菇多糖、银耳多糖等，具有很好的免疫调节作用，能够增强单核细胞吞噬功能以及T、B细胞的免疫功能，但目前研究基础十分薄弱。任燕等[44]研究了蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷(Castor oil polyethylene glycol monoester glucoside, CPMG)对灭活细菌浸泡疫苗的佐剂效应，免疫30 d后进行攻毒，同时用含CPMG和山莨菪碱复合佐剂的灭活疫苗二次浸泡免疫试验鱼，30 d后，CPMG组的相对保护率为70.6%，复合佐剂组为88.2%，均显著高于无佐剂组的56.0%。刘冉阳[45]制备了甲醛灭活哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)疫苗，分别以黄芪多糖和蒲公英多糖为佐剂，评价疫苗的保护效果，结果显示接种蒲公英多糖配合疫苗组的相对免疫保护率为82.46%，黄芪多糖配合疫苗保护率为78.95%，灭活疫苗的保护率为73.68%，两种多糖作为免疫佐剂均能够提升哈维氏弧菌灭活疫苗对牙鲆的保护效果。中草药佐剂在安全性方面具有一定优势，但目前研究基础十分薄弱，仅从其对免疫保护力、抗体水平、免疫细胞及免疫因子的调节表达来研究佐剂效应，其作用机理仍不明确。

4 小结

佐剂在疫苗中已经使用了90多年，用于增强机体对抗原的免疫反应。对于新型疫苗研发来说，纯化的保护性抗原与特异性和靶向性佐剂的辅助同等重要，佐剂已成为许多疫苗的必要组成部分。佐剂有助于抗原触发特定的免疫过程，减少强烈副作用的产生，使疫苗免疫原性及引起的免疫应答最大化。因此，抗原和佐剂的正确匹配可以增强适应性免疫反应，从而能够开发出新的有效疫苗。但由于对新型佐剂（例如TLR配体或细胞因子）的功效及作用机制和配伍的基础研究不够深入，新型佐剂尚未用于商业化疫苗生产，目前商业化的鱼类疫苗仍使用油佐剂。在未来的疫苗研究中，应明确疫苗各组分组成中各物质的免疫功能，综合评价疫苗效价和功效，促使疫苗行业从油佐剂转向能够特异性地触发足够免疫反应的新型佐剂，从而获得针对特定病原体尤其是病毒性病原的高效疫苗。