镁、锰对烤烟DXP途径中间物质及部分有机酸、高级脂肪酸含量的影响

李国明，祖庆学，冯裕祥，廖 恒，张 涵，陆引罡,4

(1.贵州大学 农学院，贵州 花溪 550025；2.贵阳市烟草公司开阳县分公司，贵州 开阳 550300；3.贵州省土壤肥料研究所，贵州 花溪 550025；4.贵州省烟草品质研究重点实验室，贵州 贵阳 550025)

镁(Mg)和锰(Mn)是烤烟正常生长必需的营养元素。镁是叶绿素组分中的唯一金属元素，锰通过影响叶绿体膜的合成进而影响叶绿素的合成，二者是多种酶的辅助因子，可以激活酶的活性，促进植物体内多种酶促反应的进行，对烟草生理代谢及品质形成均有重要作用[1-6]。一方面，镁、锰通过活化酶，影响烤烟萜类化合物的合成。萜类化合物是烟草的重要化学成分之一，不仅对烟草的生长发育具有重要的生理意义，而且对烟草品质的形成尤其是香气的产生具有重要作用[7]。二萜类物质是其中一种极为重要的香气前提物质，而西柏烷类化合物是烤烟二萜类物质的重要组成成分，在一定程度上影响烤烟的香气质量和烟气特征[8-12]。异戊烯焦磷酸(IPP)是合成萜类化合物的直接前提物质，IPP的合成通过2个途径进行，即位于细胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径[13]和位于质体中的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)途径[14]或甲基赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径[15]。MVA途径主要合成植物细胞质中的倍半萜、三萜及多萜，DXP/MEP途径主要合成植物质体中的单萜、二萜和四萜[16-18]。烤烟通过DXP途径形成IPP，IPP进一步衍化形成萜类物质，进而影响香气质量。另一方面，镁、锰通过影响叶绿素的合成以及对多种酶的活化作用对三羧酸循环产生影响，进而影响烟草有机酸及高级脂肪酸的含量。烟草中的有机酸对烟草生长过程中的生理代谢起着重要作用[19]。有机酸与生物碱反应生成盐类物质，或以脂类的形态存在于烟叶中，通过调节化合态和游离态2种类型烟碱的比例，影响烤烟生物量，进一步影响烤烟的吸味、劲头及刺激性[20-21]。高级脂肪酸通过酶或非酶作用降解转化成低分子的致香成分[20,22]，不饱和脂肪酸能够增加卷烟的丰满度和粗糙感[23]，是衡量烤烟品质的重要指标之一。陈思昂等[24]研究认为，不同部位烟叶挥发性有机酸含量均对烤后烟叶pH值、香气、刺激性具有显著影响。

目前，不同海拔、温度、光照、品种等对烤烟香气质量的影响较多，关于烤烟镁、锰肥的研究主要集中在对烤烟产量的影响方面，对香气质量的影响研究鲜有报道。鉴于此，以贵州烟区主栽品种云烟87为研究对象，研究了镁、锰不同施用量条件下烤烟DXP途径中关键物质及部分有机酸、高级脂肪酸含量的变化，为贵州烟区主栽品种云烟87烟叶品质的提升提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验地点和供试材料

试验于2019年4—9月在贵州大学南校区盆栽场进行，供试烤烟品种为云烟87，由贵州省开阳县烟草公司提供。硫酸镁(MgSO4·7H2SO4)、硫酸锰(MnSO4)均为分析纯，由成都金山化学试剂有限公司提供。供试肥料为贵阳市现行施用的烤烟专用基肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=9∶10∶27]和烟草专用追肥[m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=13∶0∶26]，由湖北香青化肥有限公司提供。供试土壤取自贵州大学西校区农学院后山(106°39′35″E，26°26′54″N)，主要理化性质为全氮1.39 g/kg，碱解氮54.41 mg/kg，有效磷23.56 mg/kg，速效钾124.37 mg/kg，有机质15.22 g/kg，pH值6.54。

1.2 试验设计

设置5个处理，分别记作CK(硫酸镁=0 g/株，硫酸锰=0 g/株)、T1(硫酸镁=10 g/株)、K1(硫酸锰=10 g/株)、T2(硫酸镁=20 g/株)、K2(硫酸锰=20 g/株)。试验常规氮肥基追肥比为7∶3，盆栽试验施肥量为大田施肥量的3倍，基肥和追肥用量分别为136.6 g/株和41.0 g/株；根据CK、T1、T2、K1、K2，将不同施用量硫酸镁、硫酸锰与基肥和土壤一起充分混匀装盆，每盆20 kg。试验采取随机区组排列，重复3次，每个处理3盆，每盆植烟1株，共计45盆。4月20日，选取健壮、整齐的烟苗进行移栽，各处理均采用相同的施肥手段和烤烟管理标准，并于烤烟移栽后35 d统一施入烟草专用追肥。

1.3 样品采集与测定分析

1.3.1 烤烟DXP途径中间产物含量的测定 DXP途径中间产物(主要包括丙酮酸、DXP、IPP)含量采用GC-MS进行测定。取各处理成熟期中部叶片(从下往上数第9片)，所取样品经105 ℃杀青0.5 h，65 ℃烘干，经磨碎后过1 mm筛，装袋编号后备用，称取3.000 0 g粉末样品于50 mL离心管中，加入15 mL二氯甲烷，涡旋1 min，混匀，超声提取20 min，重复提取2次，将所得提取液过无水硫酸钠层于100 mL圆底烧瓶中旋转蒸发至近干，用二氯甲烷定容至5 mL，过滤膜，上机分析。利用Shimadzu GCMS-QP2020 气相色谱质谱联用仪分析。由于送样检测时，测试公司未能买到对应指标的标准药品，故以峰面积的形式表示含量。

1.3.2 烤烟西柏烯二萜醇含量的测定 分别于团棵期、旺长期、成熟期选定烟株的功能叶片(从下往上数第9片)，样品经105 ℃杀青0.5 h，65 ℃烘干，经研磨后过1 mm筛，装入自封袋编号备用。准确称取0.500 0 g烟末，置于100 mL锥形瓶中，加入50 mL提取溶液(0.005 g/mL正十七烷醇-二氯甲烷溶液)，超声振荡10 min后，用装有5 g无水硫酸钠的滤纸滤去烟末。取10 mL滤液至浓缩瓶中，在500 mba、40 ℃条件下浓缩去除溶剂。加入500 μL N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)和500 μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，洗涤浓缩瓶内壁，将所得溶液转入色谱瓶。在75 ℃水浴中进行衍生化反应60 min，得到GC/MS分析样品溶液[25]。利用Shimadzu GCMS-QP2020气相色谱质谱联用仪分析。

1.3.3 烤烟部分有机酸及高级脂肪酸含量的测定 采用H2SO4-CH3OH溶液衍生化反应进行样品处理，用气相色谱仪进行测定[26]。称取0.500 g烟末于干燥三角瓶中，加入25 mL 7% H2SO4-CH3OH溶液，准确抽取100 μL内标溶液(0.05 g/mL己二酸-甲醇溶液)，摇匀，室温放置20 h进行甲酯化反应,用滤纸过滤到盛有50 mL蒸馏水的分液漏斗中，二氯甲烷萃取(100 mL×3)，萃取液加无水硫酸钠干燥后，直接取1.0 μL进样分析。有机酸和脂肪酸标样采用完全相同的处理过程，以制备内标法校正工作曲线并对各酸进行保留时间对照法定性。采用GC-14B气相色谱仪分析。

1.4 数据处理与统计分析

采用Excel 2016、Origin 2018和DPS 7.05进行数据整理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 镁、锰对烤烟DXP途径中间物质含量的影响

2.1.1 丙酮酸 图1a显示，施用镁、锰后，成熟期烟叶丙酮酸含量较CK显著增加。T1、K1、T2、K2较CK分别提高9.14%、10.72%、16.65%、14.59%，以T2处理烟叶丙酮酸含量最高。可能是因为丙酮酸主要由糖酵解产生，镁、锰作为糖酵解中磷酸果糖激酶的催化物，可以促进糖酵解的进行，进而增加丙酮酸的含量。

2.1.2 DXP 图1b显示，施用镁、锰后，成熟期烟叶DXP含量较CK显著增加。T1、K1、T2、K2较CK分别提高8.44%、5.87%、22.78%、21.44%，以T2处理烟叶DXP含量最高，相同施用水平条件下，镁对烤烟叶片DXP含量的增加效果较锰更明显。一方面可能与镁、锰作为1-脱氧-5-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)的催化剂相关，另一方面可能与丙酮酸含量增加有关。

2.1.3 IPP 图1c显示，施用镁、锰后，成熟期烟叶IPP含量较CK显著增加。T1、K1、T2、K2较CK分别提高13.29%、17.13%、33.68%、25.52%，以T2处理烟叶IPP含量最高。可能与镁、锰促进相关反应酶活性及上游物质含量增加有关。

不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05),下同

2.2 镁、锰对烤烟西柏三烯二醇含量的影响

2.2.1 α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇 图2a表明，烤烟α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量随生育时期的推进呈先增加后降低的趋势，整体表现为旺长期>成熟期>团棵期。与CK相比，施用镁、锰离子可以显著提高烤烟叶片α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇的含量，且在一定范围内随施用量的增加而增加。在施用量20 g/株条件下，旺长期施镁的烟株α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量显著高于施锰的烟株，其余同水平施用条件下，分施镁、锰对烤烟α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量的影响无显著差异。团棵期，T1、K1、T2、K2处理α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量分别较CK提高12.8%、15.14%、31.48%、33.37%；旺长期分别较CK提高8.56%、6.31%、26.46%、17.13%；成熟期分别提高6.22%、5.19%、11.99%、10.06%。

2.2.2 β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇 图2b表明，烤烟β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量与α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量的变化规律相似，团棵期，T1、K1、T2、K2处理β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量分别较CK提高25.54%、26.14%、46.79%、52.24%；旺长期分别提高10.4%、8.68%、39.57%、35.62%；成熟期分别提高27.61%、25.76%、36.72%、34.71%。

图2 镁、锰对烤烟α-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇(a)、β-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇(b)含量的影响

综上，施用镁、锰均能有效提高烤烟西柏三烯二醇的分泌和积累，施镁处理效果更佳。

2.3 DXP途径中间物质含量的相关性分析

由表1可知，对镁、锰不同施用量条件下烤烟DXP途径各项产物含量进行相关性分析，结果表明，烤烟DXP途径各级反应产物含量正相关。施镁条件下，丙酮酸、IPP含量与α-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇含量，DXP含量与IPP含量均呈极显著正相关关系；施锰条件下，丙酮酸含量与IPP、β-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇含量，IPP含量与β-4,8,13-西柏三烯-1,3-二醇含量均呈极显著正相关关系。DXP途径自上而下，由丙酮酸到DXP、IPP再到2种西柏三烯二醇，含量均随镁、锰施用量的增加而增加。综上，施用镁、锰可以促进烤烟DXP反应途径的进行，对烤烟主要香气物质的产生起到调控作用。

表1 施用镁、锰后烤烟DXP途径中间物质含量相关性分析

2.4 镁、锰对烤烟部分有机酸含量的影响

2.4.1 苹果酸 图3a显示，烤烟苹果酸含量随生育期的推进呈增加趋势。与CK相比，施用镁、锰总体上显著提高苹果酸的积累量，在一定范围内随施用量增加而增加，且同水平施用条件下，分施镁、锰效果差异不显著。团棵期，T1、K1、T2、K2处理烤烟苹果酸含量分别较CK提高4.89%、3.83%、14.91%、17.79%，旺长期分别提高6.13%、5.53%、17.95%、16.52%，成熟期分别提高6.99%、6.03%、21.77%、17.20%。

2.4.2 柠檬酸 图3b显示，烤烟柠檬酸含量随生育期的推进呈先减后增的趋势。与CK相比，施用镁、锰总体上显著提高柠檬酸的积累量，在一定范围内随施用量增加而增加。在20 g/株施用水平下，施锰效果更好。团棵期，T1、K1、T2、K2处理烤烟柠檬酸含量分别较CK提高5.31%、7.28%、18.83%、20.92%；旺长期分别提高13.30%、16.64%、34.94%、46.42%；成熟期分别提高9.20%、13.40%、19.71%、35.48%。

图3 镁、锰对烤烟苹果酸(a)和柠檬酸(b)含量的影响

综上，镁、锰处理均有利于烤烟苹果酸和柠檬酸的积累，施镁处理更有利于苹果酸的积累，施锰处理更有利于柠檬酸的积累。

2.5 镁、锰对烤烟部分高级脂肪酸含量的影响

2.5.1 油酸 图4a显示，烤烟油酸含量随生育期推进呈先增后减的趋势。与CK相比，施用镁、锰可以显著增加烤烟油酸含量，且在一定范围内随施用量的增加而增加。团棵期，T1、K1、T2、K2处理烤烟油酸含量分别较CK提高15.21%、18.43%、35.02%、52.53%；旺长期分别提高18.16%、16.88%、38.36%、34.27%；成熟期分别提高18.66%、9.51%、27.46%、24.30%。

2.5.2 亚油酸 图4b显示，不同处理烤烟亚油酸含量的变化规律与油酸基本相同。团棵期，T1、K1、T2、K2处理烤烟亚油酸含量分别较CK提高1.76%、25.29%、46.47%、52.94%；旺长期分别提高19.17%、9.22%、33.74%、28.88%；成熟期分别提高25.37%、12.87%、43.38%、36.76%。

图4 镁、锰对烤烟油酸(a)和亚油酸(b)含量的影响

综上，镁、锰均可促进烤烟油酸、亚油酸的积累，施镁处理更有利于2种高级脂肪酸的积累。

3 结论与讨论

西柏烷类致香物质是烟叶中重要的致香前体物，通过一定的降解途径可形成多种醛、酮等致香成分，从一定程度上影响烤烟的香气质及香气量[27]。本研究结果表明，烤烟在生育过程中，中部烟叶α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇和β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量呈先升后降的趋势，即旺长期>成熟期>团棵期，与赵华新等[28]的研究结果一致。可能是因为烟叶成熟后烤烟西柏三烯二醇易降解形成茄酮等致香类物质导致西柏三烯二醇含量下降。韩锦峰等[8]研究表明，提高烤烟中西柏三烯二醇含量，可以有效改善烤烟的香气质，提高其香气量。本研究表明，施镁条件下，丙酮酸含量与DXP、IPP、(α、β)-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、DXP含量与IPP、α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、IPP含量与α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、α-与β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量均呈显著或极显著正相关关系；施锰条件下，丙酮酸含量与IPP、(α、β)-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、DXP含量与α-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、IPP与(α、β)-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量、α-与β-4，8，13-西柏三烯-1，3-二醇含量均呈显著或极显著正相关关系，可见，施用镁、锰肥均可以促进烤烟DXP途径的顺利进行，促进烤烟西柏三烯二醇含量的积累，且施镁比施锰效果更佳，其中，在20 g/株的施用水平下，相对效果最好。可能是因为镁、锰均作为糖酵解途径、DXP途径关键酶的催化剂，能够活化反应所需要的磷酸激酶，但锰的催化效果不如镁好。同时，镁作为叶绿素组分中的唯一金属元素[1]，施用镁肥更有利于提高烤烟叶绿素含量，增加光合产物含量，提高叶片淀粉积累量，为糖酵解产生丙酮酸提供充足的原料。丙酮酸作为DXP途径的起始物质，其含量增加可以促进下游关键产物DXP、IPP含量增加，进而更有利于烤烟西柏三烯二醇含量的积累。

苹果酸能够降低烟气的pH值，改善高生物碱的烟草烟气; 而柠檬酸含量较高则会降低烟叶质量，导致吃味变差；不饱和脂肪酸能够增加烟气的丰满度和粗糙感。烟草生长发育过程中，苹果酸、柠檬酸等非挥发性有机酸的生物合成和降解主要发生在三羧酸循环中[19]。符新妍等[29]研究表明，烤烟在叶龄40 d前，代谢旺盛，呼吸作用产生大量苹果酸，一定程度抑制了苹果酸脱氢酶的活性，导致柠檬酸含量降低，随叶龄增加，苹果酸积累速度下降，底物反馈抑制效应削弱，苹果酸脱氢酶活性逐步增加，最终表现为苹果酸含量呈现缓慢增加趋势；而柠檬酸含量则先降低后缓慢增加，与本试验结果一致。本研究发现，施用镁、锰肥之后，烤烟的苹果酸、柠檬酸含量均有不同程度的提升。姚莉等[30]认为，施镁可以显著提高烟叶中非挥发性有机酸和高级脂肪酸的含量，与本研究结果一致。

综上所述，施用镁、锰可以调控烤烟中DXP途径的进行，显著提高烤烟西柏三烯二醇及部分有机酸、高级脂肪酸的含量，施镁效果优于施锰，硫酸镁施用量为20 g/株效果最好。但由于试验设计及条件的限制，对于是否存在更佳的镁肥、锰肥施用量有待进一步研究。