双草醚对烟草生长的影响及其降解规律研究

房 宽，徐 茜，林 卿，林 伟，张晓莲，刘亚磊，王秀国，宋江雨，刘建阳，刘 通

(1.中国农业科学院 烟草研究所，山东 青岛 2661002；2.中国农业科学院 研究生院，北京 100081；3.福建省烟草公司南平市公司，福建 南平 353000)

烟草作为一种重要的经济作物，具有多种种植方式，其中稻烟轮作是较为广泛的模式之一。大田生产过程中，多种方法被用于烟草病虫草害防治，其中，化学防治备受农民欢迎，除草剂销量也一直较高，但是，现今除草剂市场鱼龙混杂，且所需应用技术高，稍有不慎就会出现药害。目前已知的除草剂品种达几十种，主要有激素类的二氯喹啉酸，杂环类的灭草松、酰胺类的异丙甲草胺等，这些除草剂大都具有用量少、适用范围广等优点[1]，但随着施药量的增大和不规范使用，除草剂对作物也产生了药害作用，主要包括广泛残留性、技术性、飘移性[2]3种药害，由于防治知识和手段的匮乏，且防治不积极，导致烟株受害加重、烟叶产量降低，对轮作作物也会产生不良影响。双草醚是一种典型的嘧啶苯甲酸类除草剂，使用后会快速被植物吸收，药效发挥迅速，且用药量较少，具有广谱性，可有效防治稻烟轮作系统中的多种杂草[3]，由于药效极佳，双草醚近年来被广泛使用，但由于双草醚本身的性质、天气原因以或不当使用，药害频繁发生，导致烟草经济收入降低，民事纠纷时常发生[4]。

目前，国内对于双草醚的研究大多停留在防效试验以及科学使用方面，如余铮等[5]、嵇方针等[6]研究了多种除草剂在水稻上的药效试验；彭凯灵等[7]研究了双草醚对直播稻田中杂草的防治效果；贾忠建等[8]研究了双草醚的科学正确使用方法，郭之杰[9]、肖慰祖等[10]研究了助剂对双草醚药效的影响。但以往研究没有对除草剂残留产生的药害症状、生理性状变化进行系统探究，无法计算出致害剂量，不能对田间施药安全间隔期进行合理评估。鉴于此，通过大田试验和室内盆栽试验，主要采用药害症状识别试验、生理性状变化试验、残留消解试验等方法识别烟株的药害症状，探究烟株农艺性状和体内激素含量变化，分析双草醚的残留消解规律，评估田间施药安全间隔期，以期促进双草醚在稻烟轮作区的科学正确使用，减轻药害发生程度，推动烟草安全生产。

1 材料和方法

1.1 试验地点及供试材料

试验于2017年在福建烟草公司南平市公司南平市烟草农业科学研究所试验基地进行。10%双草醚可分散油悬浮剂由陕西上格之路生物科学有限公司提供，双草醚标准品(98.5%)由德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司提供；供试烟草品种为NC89。

1.2 试验设计

1.2.1 双草醚田间药害试验 10%双草醚可分散油悬浮剂推荐剂量为300 mL/hm2，设计推荐剂量的1/4、2、5、10倍4个不同的施药剂量，施药方法：4个施药剂量均对水3 000 mL稀释，对烟株根部均匀喷施，喷施时间为烟株团棵期和旺长期。每个施药剂量3个重复，每个重复为10株生长状况相对一致的烟株，各施药剂量处理之间相隔2个未经药剂处理的烟株，插牌做好标记。定期使用相机拍照，记录烟株受害情况。

1.2.2 双草醚盆栽烟草药害试验 分别设计10%双草醚可分散油悬浮剂推荐剂量的0(CK)、1/8、1/4、1/2、1、2、5倍7个不同施药剂量对土壤进行处理，其中CK采用清水处理。施药方法：根据不同施药剂量对水500 mL稀释，采用喷雾法分别施加到10 kg土壤中，使土壤含水量达到土壤最大持水量的60%。充分搅拌均匀后，将处理好的土壤置于直径32 cm、高25.5 cm的塑料花盆内，每个剂量5个重复。将花盆置于大棚内，将试验烟草移入花盆中，温湿度、水肥操作均按正常农事操作进行。定期使用相机拍照，记录烟株受害情况。

1.2.3 双草醚残留降解试验

1.2.3.1 盆栽土壤和烟草中的残留降解 上述盆栽样品于施药后1 h，1、3、5、10、15、20、30、40、50、60 d采集土壤样品和烟叶样品。采集土壤样品时，将同一剂量处理土壤样品混匀后过孔径2 mm筛，然后利用四分法留取土壤样品200 g；采集鲜烟叶样品时，将同一剂量处理的鲜烟叶样品混合，切碎混匀，然后利用四分法留取样品50 g。采集样品后立即置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3.2 田间土壤中残留降解 由于田间经常出现农民大剂量多次用药，故采用10%双草醚可分散油悬浮剂10倍推荐剂量作为施药剂量，即3 000 mL/hm2，累计施药3次，每次施药间隔10 d。利用土钻在处理后1 h，1、3、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80 d分别钻取试验地0～10 cm土层土壤样品。采用“S”形取样方法进行多点取样，每次取样不得少于1 000 g，将土样过孔径2 mm筛，然后采用四分法留样300 g，置于-20 ℃冰箱内保存。同时，采集空白对照(CK)。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 双草醚残留量 采用液相色谱-质谱系统测定，液相色谱柱为Thermo Hypersil GOLD C18，色谱柱为2.1 mm×100 mm，3.0 μm，柱温为25 ℃，流速为0.25 mL/min，进样量为10 L。定性、定量离子分别为239.9/35.2(m/z)、239.9/196.0(m/z)。提取以及净化方法参照刘修园[11]的方法进行。

1.3.2 烟草农艺性状 盆栽试验于施药后第30、40、50、60天观察烟草的农艺性状差异，并利用标准卷尺测量烟株的株高、最大叶片的长和宽，计算烟株叶面积。抑制率公式如下：

株高抑制率=(对照平均株高-处理平均株高)/对照平均株高×100%，

叶面积抑制率=(对照平均叶面积-处理平均叶面积)/对照平均叶面积×100%[12]。

1.3.3 烟草激素含量 在步骤1.2.3.2中，分别于10%双草醚可分散油悬浮剂10倍推荐剂量施药后，于团棵中后期(移栽后30 d)，随机采集大田烟株药害明显的心叶部位样品以及中上部位叶片样品，分类保存后，分别取10 g样品，依据易勇等[13]的方法提取赤霉素(GA3)、生长素(IAA)、脱落酸(ABA)3种内源激素并用UPLC-MS/MS测定含量。

1.4 数据处理与分析

大田消解试验中，双草醚在土壤中的降解半衰期计算公式：

Ct=C0e-kt，

T1/2=ln2/k

式中，Ct为t时刻土壤中双草醚的含量(mg/kg)，C0为双草醚初始含量(mg/kg)，k为反应速率常数(d-1)，T1/2为双草醚在土壤中的降解半衰期(d)。

致害临界值：叶面积抑制率以及株高抑制率为10%～15%时的施药剂量，以株高抑制率为主要参考标准[14]。

施药安全间隔期：将土壤中除草剂致害临界含量数值代入除草剂大田消解动态方程，即可对施药安全间隔期进行评估[11]。

利用Microsoft Excel 2010、SPSS 16.0分析处理数据。

2 结果与分析

2.1 双草醚的药害识别

2.1.1 田间烟草药害识别 不同剂量双草醚药剂处理15 d后，其在烟草上的药害症状随施药剂量升高而加重。10%双草醚可分散油悬浮剂1/4倍推荐剂量处理组没有明显药害产生，2倍推荐剂量处理组产生轻微药害，5倍和10倍推荐剂量处理组药害症状最为明显。图1为10倍推荐剂量处理后，烟株在团棵期(图1A、B、C)和旺长期(图1D、E、F)的药害症状。团棵期药害症状为烟叶变黄且出现卷曲现象，烟株中部与底部叶片产生褐色药斑，烟株矮化，节间距离变短；旺长期药害症状为烟株整体黄化，底部叶片有褐色药斑且枯萎坏死，叶片中部叶脉有褐色药斑，烟株矮化严重，节间距离变短。

A、B、C:团棵期; D、E、F:旺长期

2.1.2 盆栽烟草药害识别 如图2所示，药剂处理40 d后，10%双草醚可分散油悬浮剂1/8、1/4、1/2倍推荐剂量对烟株影响较小；2、5倍剂量产生药害症状较为明显，严重影响烟株的生长发育，主要表现为烟株矮化较为明显，叶片有明显变黄的趋势，产生严重药害后烟株难以恢复。

CK: 0倍推荐剂量; Ⅰ—Ⅵ:分别表示1/8、1/4、1/2、1、2、5倍推荐剂量

2.2 双草醚致害烟草的农艺性状和生理性状变化

2.2.1 农艺性状 如表1所示，双草醚处理后，除空白对照外，不同剂量处理对烟草株高和叶面积均有影响，其中1/8、1/4倍推荐剂量处理组对烟株农艺性状的影响较小，但随施药剂量增加和药后时间增长，烟株农艺性状受到的影响逐渐增强，其中，对于叶面积抑制率最高达90.6%，对株高的抑制率最高达77.9%。在药后60 d，双草醚对烟草叶面积和株高的抑制作用效果大致相同，5倍推荐剂量处理对烟草株高和叶面积的抑制率均大于60%。

表1 10%双草醚可分散油悬浮剂推荐剂量不同施药倍数处理的盆栽烟株农艺性状变化

2.2.2 激素含量 在多种内源激素中，IAA、GA3、ABA对烟草生长起着举足轻重的作用，其中，GA3具有促进作物生长发育，促进发芽、分蘖、抽薹的作用；IAA的作用在于调节植物的生长，促进生长发育；ABA对植株生长发育起抑制作用，促进植物衰老，引起气孔关闭，植物处于逆境时会大量分泌此激素。植物生长发育旺盛时，IAA、GA3含量较高，ABA含量较低，处于逆境时则相反[15]。因此，可以根据烟株体内这3种激素的变化，从微观角度观察外界因素致使烟株产生的不良症状。

由图3可见，10%双草醚可分散油悬浮剂10倍推荐剂量处理后，受害烟株心叶与中上部叶片内激素含量发生不同程度变化。其中，与CK相比，双草醚处理后中上部叶片中IAA、GA3含量分别显著降低42.2%、74.6%(P<0.05)，ABA含量显著增加47.7%(P<0.05)。双草醚处理后心叶中IAA、GA3含量分别较CK显著降低23.6%、33.4%(P<0.05)，而ABA含量与CK没有显著变化(P≥0.05)。由此可以看出，10%双草醚可分散油悬浮剂10倍推荐剂量处理后，受害烟株的细胞分裂、生长发育功能受损，烟株开始进行程序性凋亡来应对双草醚药害胁迫，这与药害识别试验中植株矮小、节距变短、叶片坏死等不良症状相互印证。

不同字母表示不同处理相同激素差异显著(P<0.05)

2.3 双草醚残留消解动态

2.3.1 双草醚在盆栽土壤中的残留动态 如图4可见，盆栽试验中，10%双草醚可分散油悬浮剂推荐剂量的1/8、1/4、1/2、1、2、5倍处理土壤中双草醚原始沉积量分别为 0.004、0.007、0.013、0.026、0.059、0.149 mg/kg；施药15 d 后，双草醚在各处理组盆栽土壤中的降解均达到1/2以上。出现以上现象的原因可能是在药剂处理后0～15 d，烟株受害程度较小，烟株生命力旺盛，新陈代谢较快，因此,土壤中双草醚残留量下降较快；药剂处理后15～60 d，烟株受害程度加深，烟株各种生命活动减缓，土壤中双草醚降解速率降低。

图4 10%双草醚可分散油悬浮剂在盆栽土壤中的残留动态

2.3.2 双草醚在盆栽烟叶中的残留动态 盆栽试验中，不同剂量双草醚处理药后30、40、50、60 d烟叶中的双草醚残留结果如表2所示，10%双草醚可分散油悬浮剂 1/8、1/4 倍推荐剂量处理均未检测双草醚残留；10%双草醚可分散油悬浮剂 1/2、1、2、5倍推荐剂量处理在药后30 d之后，随时间延长，双草醚残留量呈降低趋势，药后60 d最终残留量分别为0.001 6、0.002 4、0.007 6、0.082 0 mg/kg。

表2 10%双草醚可分散油悬浮剂在盆栽烟叶中的双草醚残留

2.3.3 双草醚在田间土壤中的消解动态 由图5可见，10%双草醚可分散油悬浮剂10倍推荐剂量处理土壤中双草醚的原始沉积量为0.586 mg/kg，施药10 d后，双草醚在土壤中降解率超过50%，施药80 d后，双草醚最终残留量为0.014 mg/kg。由一级动力学方程可得，双草醚在大田土壤中的理论半衰期为15.4 d。

图5 双草醚在田间土壤中的残留动态

2.3.4 双草醚产生药害的剂量及安全间隔期 根据双草醚在盆栽烟草和田间烟草产生药害的时间和症状，结合在盆栽、大田中的残留状况，计算出产生药害的临界剂量，代入消解动态方程，可对双草醚大田安全间隔期进行评估。

在盆栽烟株农艺性状变化试验中，以150 mL/hm2的10%双草醚可分散油悬浮剂处理40 d后，烟株叶面积抑制率以及株高抑制率在10%～15%，因此，150 mL/hm2可作为10%双草醚可分散油悬浮剂致烟草药害的临界药剂用量，此时在盆栽土壤和烟草叶片中，双草醚含量分别为 0.012 0、0.018 5 mg/kg；据双草醚大田消解动态试验，双草醚在田间土壤中的消解动态方程为y=0.467 3e-0.046x，将产生药害时土壤中双草醚含量(即y=0.012 0 mg/kg)代入田间消解动态方程，得到双草醚在大田中的施药安全间隔期(x)为85 d。

3 结论与讨论

烟草在我国国民经济中具有相当重要的作用。近年来，烟草质量安全问题已成为研究热点，其中农药残留问题是影响烟草经济可持续发展的重要因素。由于自然气候以及土壤理化性质的影响，不同剂量除草剂的降解速率会产生差异，继而引起不同的药害症状，因此，明确除草剂药害症状的差异，并与其在土壤和植株中的残留量变化相结合，有助于除草剂药害症状的快速识别，继而制定相应的对策，符合农业生产实际。从本研究结果来看，10%双草醚可分散油悬浮剂1/4倍推荐剂量下无明显药害产生，但随着施药剂量的升高，烟草药害症状愈发明显，5、10倍推荐剂量处理甚至出现枯萎坏死症状，这与杨森等[16]研究除草剂土壤残留导致烟草药害的结果一致。

株高、叶面积等农艺性状对烟草质量和产量有着重要影响，探究双草醚对烟草农艺性状的影响，结合烟草药害症状以及激素含量变化，可掌握不同剂量双草醚对烟草产生的影响，对田间施药具有较高的借鉴意义。植物激素是一类植物自身体内分泌痕量化合物[17]，植物内源激素在代谢、生长和形态建成等植物生理活动各方面均起着重要的调节作用[18]。明确烟草激素含量变化，并结合农艺性状的变化，有助于分析除草剂药害产生的原因。在激素水平，双草醚药害导致烟株激素含量紊乱，抑制烟草IAA、GA3合成，导致烟株叶片细胞无法正常分裂、伸长，进而引起植株矮化，叶面积变小；同时引起ABA含量增高，导致叶片气孔关闭和新陈代谢受阻，进而影响植物生长发育。在农艺性状水平上，双草醚药害抑制叶面积和株高的正常生长，导致植株瘦小，生长畸形，在施药处理末期，高剂量双草醚处理对烟草株高和叶面积的抑制率均高于60%，这与于庆涛等[19]研究除草剂对烟株生长发育的影响结果基本一致。

双草醚施用剂量与药害存在着时间-剂量效应关系，即随药后时间的延长和施药剂量的增大，双草醚残留对烟株生理性状的影响越大，药害症状越明显。根据双草醚残留消解动态试验可得，双草醚理论半衰期 15.4 d，大田土壤中的最终残留量为0.014 mg/kg，施药剂量越高，残留量越高，降解半衰期越长。

本研究结果表明，10%双草醚可分散油悬浮剂致烟草药害的临界施药剂量为150 mL/hm2，此时，在大田土壤和叶片中的双草醚含量分别为0.012 0、0.018 5 mg/kg，安全间隔期为85 d。因此，在稻烟轮作区，若土壤中双草醚含量超过0.012 0 mg/kg，建议先采取措施降解农药残留再种植烟草；若在生长的烟草中检测到双草醚含量超过0.018 5 mg/kg，应该及时采取措施，防止药害进一步扩大；每次施药间隔不得少于85 d。