基于单克隆抗体的胶体金免疫层析法快速检测丙溴磷

2021-01-14 07:30王兆芹张富生邓家军马玉华崔廷婷万宇平
河南农业科学 2020年12期
关键词:层析胶体金检出限

王兆芹,张富生,邓家军,马玉华,崔廷婷,3,崔 娜,万宇平,3

(1.北京勤邦生物技术有限公司,北京 102206;2.江西省农产品质量安全检测中心,江西 南昌 330046;3.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心,北京 102206)

丙溴磷(Profenofos)是一种广谱高效、中等毒性的非内吸性有机磷杀虫剂,具有触杀和胃毒作用,主要用于防治蔬菜水果及粮食作物上的害虫[1]。但随着其使用量日渐增多,必然会对环境及食品造成污染[2-3],危害人类健康。目前已有研究表明,丙溴磷可破坏中枢神经系统胆碱能神经的正常功能[4-5],还对红细胞有明显毒性[6]。因此,我国GB 2763—2019中规定了不同食品中丙溴磷的残留限量[7]。

目前已报道的检测丙溴磷残留的方法主要有色谱法[8-10]和色谱质谱联用技术[11-13],这些方法灵敏度和准确度较好,但样品前处理复杂,需要昂贵的仪器设备及专业的技术人员,不适合基层实验室推广使用。为满足大量样品现场快速检测的需要,基于免疫层析技术,研制了丙溴磷的胶体金快速检测试纸条,具有操作简便、检测速度快、成本低等优点,适用于蔬菜中丙溴磷残留的现场快速筛查和检测。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

丙溴磷(纯度≥99%)、三氯硫磷、四氯化碳、丁硫醇、5-溴-3-氯-2-羟基苯甲酸、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、羊抗鼠IgG、氯金酸、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)[西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司],柠檬酸三钠、碳酸钾(K2CO3)(广州化学试剂厂),丙溴磷单克隆抗体(北京勤邦生物技术有限公司),碳酸氢钠、无水乙醇、三氯甲烷、乙腈、氢氧化钾(KOH)、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、蔗糖(北京化学试剂公司),底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水垫(上海捷宁生物科技有限公司)。

1.2 仪器与设备

2000SBL电子天平(美国Setra公司)、SBCJ磁力搅拌加热器(河南圣亚仪器仪表有限公司)、TGL16C台式高速冷冻离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)、XYZ 3050胶体金点样系统(美国BioDot公司)、CT300数控切条机(上海金标生物科技有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 半抗原的合成 丙溴磷半抗原的合成如图1所示。取1.67 g三氯硫磷加100 mL四氯化碳溶解,冷却到0~5 ℃,加入丁硫醇1.8 g、碳酸氢钠0.78 g,持续搅拌2 h,停止反应,加入0~5 ℃水80 mL,转移到分液漏斗中,快速振荡,静置分层,除去水相,有机相浓缩蒸干得到中间体1;在中间体1中加入50 mL 0~5 ℃无水乙醇溶解,加无水碳酸钾1.38 g,该温度下继续搅拌1 h,停止反应;加入0~5 ℃水120 mL、三氯甲烷150 mL,充分振荡,于分液漏斗中静置分层,除去水相,有机相浓缩蒸干得到中间体2;在中间体2中加入80 mL乙腈溶解,加5-溴-3-氯-2-羟基苯甲酸2.58 g、KOH 1.23 g,室温搅拌3 h,停止反应,旋转蒸干,加水,用乙酸乙酯萃取,有机相用无水硫酸钠干燥处理后蒸干,用硅胶柱纯化,再用二氯甲烷和甲醇体积比为10∶1的混合溶剂洗脱分离,得到丙溴磷半抗原。

图1 丙溴磷半抗原的合成流程

1.3.2 包被原的制备 采用活泼酯法将丙溴磷半抗原与OVA偶联制备包被原。将9.3 mg半抗原溶于1 mL DMF中,加入8.3 mg NHS、10.1 mg EDC,室温反应3 h,得到半抗原溶液A液;将50 mg OVA溶于0.05 mol/L 磷酸缓冲液(PB)中,得到B液;将A液滴加到B液中,4 ℃反应12 h,用0.02 mol/L 磷酸盐缓冲液透析纯化3 d,每天换液3次,得到丙溴磷半抗原-OVA偶联物,即为包被原,分装、-20 ℃保存。

1.3.3 金标抗体的制备 参考柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒[14],再将丙溴磷单克隆抗体标记到纳米金表面上。在磁力搅拌下,用0.2 mol/L K2CO3溶液将胶体金溶液的pH值调节至7.2,按每1 mL胶体金溶液中加入30 μg抗体的标准向其中加入丙溴磷单克隆抗体,搅拌混匀,室温静置10 min,加入10% BSA至其终质量分数为1%,静置10 min。然后以12 000 r/min于4 ℃离心40 min,弃去上清液,沉淀用含0.5% BSA、0.05% Triton X-100的0.02 mol/L磷酸盐缓冲液洗涤2次后复溶,在4 ℃下保存备用。

1.3.4 试纸条的制备 以包被原和羊抗鼠IgG分别作为NC膜上的检测线(T线)和质控线(C线),采用BioDot划膜仪进行划线,两线相隔5 mm,喷量1 μL/cm,使包被原质量浓度为0.4 mg/mL,羊抗鼠IgG质量浓度为0.2 mg/mL。将包被好的NC膜置于37 ℃干燥2 h,备用。

将样品垫置于处理液中浸泡2 h,37 ℃干燥2 h备用;将金标垫置于处理液中均匀浸湿1 h,37 ℃干燥3 h后,用喷膜仪将金标抗体按0.01 mL/cm的量均匀喷涂在金标垫上,37 ℃干燥1 h,备用。

试纸条由底板、样品垫、金标垫、NC膜和吸水垫组成。依次将NC膜、金标垫、样品垫、吸水垫粘贴于底板上,贴好后切成3 mm宽的试纸条,装在特制的塑料制卡中置于密封袋内,加干燥剂,密封,4 ℃保存。

1.3.5 垫材处理液的优化

1.3.5.1 金标垫展开剂的选择 以含0.5% BSA的0.02 mol/L PB作为基础液,配制A、B、C、D、E 5种不同展开剂(表1)作为金标垫处理液,并按1.3.4步骤将液体处理到金标垫上,处理干燥后的金标垫滴加2 μL 10%的金标抗体并干燥,滴加80 μL经前处理的阴性菜心样品,观察显色情况,筛选合适的金标垫展开剂。

1.3.5.2 样品垫展开剂的选择 将A、B、C、D、E 5种不同展开剂(表1)按1.3.4步骤处理到样品垫上,组装试纸条后配合已确定的金标垫使用,对比5种展开剂对胶体金层析速度、样品流动性的作用及显色情况,筛选合适的样品垫展开剂。

表1 展开剂组分

1.3.6 样品处理与检测 将新鲜样品擦去泥土(不可水洗),剪碎成小于1 cm的碎片或细碎小丁;称取1.0 g剪碎的样品至10 mL离心管中,加入6 mL 0.02 mol/L PB缓冲液(pH值7.0),盖上盖子,手动振荡30 s,静置1 min,上清液即为待测液。吸取80 μL待测液垂直滴于试纸条加样孔中,液体流动开始计时,反应10 min,肉眼判定结果。

若T线显色等于或强于C线,表示待测液中不含丙溴磷或其含量低于方法检出限,判为阴性(-);若T线不出现或出现但显色明显弱于C线,则结果为阳性(+);若C线不可见,则检测结果无效。

1.3.7 试纸条性能测定

1.3.7.1 方法检出限 选取空白菜心、白菜、油麦菜、豇豆样本,分别添加丙溴磷标准品至含量为0、0.05、0.10、0.20 mg/kg,按1.3.6步骤进行前处理,用试纸条进行检测。

1.3.7.2 重复性 测试基质为菜心,采用空白样本及丙溴磷添加含量为0.10 mg/kg的加标样本进行验证,取3个批号的试纸条进行检测,每一水平10平行,计算POD值(检出阳性结果次数占所有检测结果的比率)。

1.3.7.3 其他性能指标 随机选取空白菜心、白菜、油麦菜、豇豆样本共50份,分别添加丙溴磷标准品至含量为1.3.7.1所确定的方法检出限的0.5、1.0、2.0倍水平,共计样品200份,用试纸条进行检测,根据《食品快速检测方法评价技术规范》[15]计算灵敏度等性能指标。

2 结果与分析

2.1 金标垫展开剂的选择

金标垫释放速度过快会引起释放不均匀,表现在C、T线显色时线条不均匀;而释放速度过慢则会影响显色[16]。金标垫展开剂的选择主要解决金标抗体释放不均匀问题,提高释放速度。本研究采用5种不同配比方式的展开剂,如表2所示,不同展开剂对金标抗体释放情况影响显著,B显色最深,但均匀度不佳,影响观测效果;E显色均匀,但释放速度过慢。综合考虑几个性能,选择展开剂C作为金标垫处理液。

表2 不同金标垫展开剂的选择结果

2.2 样品垫展开剂的选择

展开剂中添加非离子表面活性剂Triton X-100,可起到增溶、润湿的作用;而糖类的加入可改善界面亲水状态,从而提高样液层析的润湿效率,使层析过程更稳定[17]。由表3可知,不同展开剂对样本的流动速度及显色差异较大。综合考虑层析速度与显色情况,选择展开剂E作为样品垫处理液。

表3 不同样品垫展开剂的选择结果

2.3 方法检出限的测定

由图2可知,当丙溴磷含量不断上升时,试纸条T线颜色由深变浅。当丙溴磷含量为0.10 mg/kg时,观察到T线颜色明显弱于C线,因此确定试纸条对丙溴磷的检出限为0.10 mg/kg。

图2 试纸条检出限测试结果

2.4 重复性测试

由表4可知,3个不同批号试纸条的检测结果中,仅批次2的试纸条在检测中出现阳性反应,其他无明显差异,表明方法重复性较好。

表4 试纸条重复性测试结果

2.5 其他性能指标测试

根据《食品快速检测方法评价技术规范》,试纸条灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率、相对准确度各性能指标的计算方法及结果见表5。试验中共计样品200份,其中阴性100份(包括空白样品和添加含量为0.5倍检出限的样品各50份),阳性100份(包括添加含量为检出限和2倍检出限的样品各50份)。

3 结论与讨论

目前还没有关于丙溴磷的胶体金免疫层析方法的报道,仅是开发针对有机磷类农药的单克隆抗体并建立免疫检测方法,如刘贤进等[18]设计采用二乙基膦酸乙酸作为通用结构半抗原,用NHS-DCC法和EDC法合成2种人工抗原免疫新西兰大白兔制备抗血清,所得抗体对毒死蜱、氧乐果、二嗪农、乙基对硫磷、丙溴磷、辛硫磷等农药有特异性反应,50%抑制浓度(IC50)分别为0.12、0.21、0.24、0.78、0.97、3.80 μg/mL;张丽杰等[19]制备针对乙氧基磷酸酯类有机磷农药的单克隆抗体,对毒死蜱、对硫磷、丙溴磷、氧化乐果、除线磷、二嗪农、溴硫磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷等农药有特异性反应,并以此为基础建立了该类农药的快速免疫筛选检测方法;朱亮亮等[20]通过制备有机磷农药半抗原,研制出一种能够检测蔬菜、水果中有机磷农药的胶体金免疫层析试纸条,对辛硫磷、对硫磷、丙溴磷、氯唑磷的检测限均为200 μg/kg。上述研究都是以有机磷农药的共有特征结构为基础制备半抗原,免疫所得单克隆抗体可以检测多种农药,针对丙溴磷检测的特异性较差。本研究通过在丙溴磷的苯环上引入羧基活性基团制备得到半抗原,该半抗原保留了丙溴磷的所有特征基团,最小改变丙溴磷原有结构特征,同时与载体蛋白偶联后,突出的是丙溴磷本身独有的含磷部分的结构,为后续刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体奠定了基础;基于此半抗原制备的丙溴磷快速检测试纸条,可特异性地快速检测蔬菜中的丙溴磷,检出限达到0.10 mg/kg;灵敏度96%、特异性93%、假阴性率4%、假阳性率7%、相对准确度94.5%,重复性较好,检测速度快,从制样到得出结果仅需15 min。

本试纸条与仪器方法相比,具有操作简便、检测速度快、成本低等优点,但由于胶体金免疫层析法主要通过肉眼观察颜色来判断结果,可能出现假阳性等问题。因此对于阳性样品,还需要用仪器方法进行确证。尽管如此,该方法作为一种快速筛查手段,可广泛用于蔬菜中丙溴磷残留的现场筛查和检测,具有重要的经济价值和社会价值。

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