定量核磁共振磷谱在食品分析检测中的研究进展

韩 智 龚 蕾 王会霞 - 江 丰

(1. 湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430070；2. 湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430070)

定量核磁共振波谱(Qualitative Nuclear Magnetic Resonance, qNMR)是20世纪新兴的食品分析检测技术，经过近60年的发展，已成为食品科学、食品分析、食品认证、食品质量控制的重要工具。与常用的现代分析技术如色谱法(气相色谱、液相色谱、薄层色谱)、波谱法(质谱、紫外可见光谱、傅里叶变换红外光谱、拉曼光谱)、电泳法(聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳)、免疫分析法、微生物学和遗传学分析法相比，qNMR在化合物定量方面具有许多优点，其允许对样品进行无损定量分析，所需样品量少，还具有高精密度、准确度、灵敏度、特异性、耐用性等优点，具有与色谱技术相媲美的适用性[1-3]。此外，qNMR还具有分析时间短、重现性高的特点，也不需要标准品即可进行定量[4-5]。

磷是人体必需元素，但过量摄入会引起高磷血症，磷的缺乏又会引起软骨病[6]。31P原子核天然丰度为100%，灵敏度为1H的1/15，在核磁共振扫描(NMR)中具有较大范围的化学位移(约7.00×10-4)，不同的含磷化合物能得到有效分离，因此定量核磁共振磷谱(31P-qNMR)技术是一种可靠的定量分析工具[7]。近年来，31P-qNMR技术被广泛应用于橄榄油等级鉴定、畜禽肉新鲜度鉴别、牛奶中甘油磷酰胆碱定量测定、酪蛋白中磷脂酰丝氨酸定量测定、淀粉来源辨别、聚磷酸盐螯合剂的检测、果蔬中有机磷农药定量测定等[8]。

目前，国内外有关31P-qNMR的综述包括人体磷脂研究[9]、橄榄油等级鉴定[10]、食品科学应用[11]、土壤分析应用[12]、食品脂质研究[13]、qNMR的高级应用[14]。但在食品分析检测中的研究尚未见报道。文章拟对31P-qNMR技术在磷脂、磷酸盐、功能成分、纯度分析、有机磷农药降解规律等方面的研究进行系统综述，旨在为31P-qNMR在食品分析检测中的应用提供依据。

1 31P-qNMR定量原理

定量核磁的基本原理为图谱中信号的响应值(即峰面积)与所检测的核(如31P)的数目呈正比，与核的化学性质无关，一般只需对该化合物中某一基团上质子引起的峰面积进行比较，即可求出其绝对含量[15]。

qNMR定量方法主要有两种：① 相对定量法(外标法)，称取一定已知含量的标准品配成一系列不同浓度的标准溶液，相同试验条件下，以特征峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，测定未知样品溶液的NMR谱图，计算其相应的峰面积，由标准曲线推算未知样品浓度。② 绝对定量法(内标法)，选择已知准确含量的标准物作为内标物，在未知样品溶液中加入已知量的内标，由内标化合物特征峰面积与样品中某一特征峰面积的比值即可计算样品浓度，内标法是qNMR最常见的定量方法，其计算公式为[16]:

(1)

式中：

mx——待测物含量，mg/L；

mstd——内标含量，mg/L；

Mx——待测物分子量；

Mstd——内标分子量；

Ax——待测物定量峰信号面积；

Astd——内标物定量峰信号面积；

nx——待测样品定量峰包含的磷原子数；

nstd——内标物包含的磷原子数。

2 31P-qNMR定量分析的影响因素

采样参数(观测核、中心频率、谱宽、采样点数、增益)、脉冲序列参数(脉冲宽度、射频场强、延迟时间、扫描次数)、数据处理参数(窗函数、变换点数、线性因子)等均会影响31P-qNMR的定量结果[17]。在实际分析检测中，标准品的选择、延迟时间、扫描次数对试验结果的影响较大。

2.1 标准品的选择

qNMR试验所选的标准品应具有结构稳定、纯度较高、易溶于氘代试剂、不与样品中任何成分发生反应、与样品定量峰分离度好、信号明显易识别等特点[15]。常用的31P-qNMR标准物质有2-氨基乙基膦酸[18]、甲胺磷[19]、胆固醇[20]、磷酸[21]、六甲基磷酰三胺[22]、亚甲基二膦酸[23]、甲基膦酸[6]、磷酸钠[4]等。

2.2 延迟时间

延迟时间(D1)直接影响激发核能否恢复至平衡基态，而能否恢复基态影响核磁的响应信号，因此合适的D1对qNMR定量结果影响较大，一般认为qNMR的D1≥5T1(5倍弛豫时间)。过长的D1增加了单次扫描所需的时间，通过加入顺磁物质可以缩短延迟时间，还可以引入校正因子f校正D1时间不足导致的定量偏差[24-25]。

2.3 扫描次数

相同操作条件下，灵敏度与扫描次数呈正比[17]，扫描次数太少，数据重现性差，对于痕量物质的分析可以增加扫描次数，以此提高仪器的灵敏度，降低物质的检出限。但扫描次数过多会造成试验效率低，因此qNMR定量需优化扫描次数，使扫描时间和灵敏度达到最佳平衡。

3 31P-qNMR在食品检测中的应用

3.1 食品活性磷脂分析检测

磷脂几乎存在于所有机体细胞中，动物磷脂主要来源于蛋黄、牛奶、动物体脑组织、肝脏、肾脏及肌肉组织，植物磷脂主要存在于油料种子中；磷脂具有生物学功能，受到世界各国的广泛关注[18]。传统的磷脂检测方法有索氏提取法、酸水解法和氯仿—甲醇提取法等，但存在耗时长，有机溶剂消耗量大的缺点，且具有毒害作用[13]。

Spyros等[7]使用2-氯-4,4,5,5-四甲基二氧磷杂环烷与单甘油脂和双甘油三酯的游离羟基进行磷酸化，在NMR谱图中将磷的响应峰进行归一化积分，得到初榨橄榄油中单甘油脂和双甘油脂的准确含量。Yao等[26]利用31P-qNMR比较了水提和酶辅助水提两种不同处理方法对全脂大豆粉、豆粕、挤压膨化豆粕及奶油中磷脂含量的影响，发现使用酶辅助水提的得率更高，该方法使用氯仿—甲醇—乙二胺四乙酸铯混合提取液提取磷脂类化合物，通过NMR直接上机定量测定，各种磷脂在谱图中得到了较好的分离，奶油中总磷脂含量为0.09%～0.75%，游离油脂含量为6%～78%。Brinkmann-Trettenes等[27]以磷酸三甲酯为内标，通过改变提取溶液的pH值，定量检测二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油4种磷脂，此4种磷脂化合物在谱图中分离度好，定量限为1.30 mmol/L，相比于传统的酶法测定，qNMR法抗干扰能力强，适合深色样品的测定，方法的相对标准偏差(RSD)为1.0%～8.7%，重复性RSD<3%。Garcia等[28]以MDPA为外标，氘代氯仿—甲醇—5 mmol/L环己二胺四乙酸铯(V氘代氯仿∶V甲醇∶V环己二胺四乙酸铯=100∶40∶20)为提取试剂，分别鉴定出人奶、马奶、骆驼奶、牛奶中含有12，11，9，7种磷脂，人奶和骆驼奶中的鞘磷脂和缩醛磷脂含量更高，分别为78.3，117.5 μg/mL，缩醛磷脂含量分别为27.3，24.0 μg/mL，这两种物质对婴幼儿的发育具有重要作用；磷脂总含量从高到低依次为骆驼奶、人奶、牛奶、马奶，含量分别为0.503，0.324，0.265，0.101 mmol/L，该检测方法具有灵敏度高、前处理简单、损失较少的优点，适合婴儿母乳替代品、营养强化剂和保健食品中磷脂含量的检测。Lucas-Torres等[29]利用31P-qNMR研究了常规加热和微波加热对橄榄油质量的变化情况，结果显示常规加热会导致二酰甘油和游离脂肪酸含量显著增加，进而损害橄榄油质量，微波加热可使橄榄油中二酰甘油之间存在异构化反应，可延长橄榄油的保质期。Dais等[30]利用高分辨率多核(1H，13C，31P)及多维NMR光谱，使用复杂的二维NMR试验，对鱼油中的各种成分进行了系统的二维分析，结果表明n-1酰基链和反式脂肪酸的含量范围分别为1.9%～2.9%，3.7%～5.2%。

崔常乐等[31]利用31P-qNMR测定了大豆磷脂中的磷脂酰胆碱，发现定量结果普遍比高效液相色谱蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)的偏大，可能是因为核磁的overhauser效应(NOE)带来了积分误差，通过重复测定，使用校正系数f将31P-qNMR的结果进行校正，结果准确。Malmos等[32]利用qNMR技术对黑巧克力中卵磷脂及铵磷脂类乳化剂类型及含量进行了精确定性定量分析，方法定量限为1.1～1.9 g/kg，准确度为4%～12%，精密度为11%～19%。Mayar等[33]比较了胆酸缓冲盐、CHCl3-MeOH-H2O混合提取液及甲醇对磷脂和溶血磷脂的提取效率，结果显示用甲醇重复提取3次的回收率和稳定性好，在400，700 MHz核磁波谱仪上的定量限分别为0.15，0.10 mg/g，加标回收率为96%～108%。Van等[34]利用400 MHz核磁定量测定了植物油原油和精炼油中磷脂和含磷降解产物，发现不同pH对不同磷脂的分离及峰型有显著影响，选择pH为9.0的提取试剂提取8种磷脂，并测定了不同目标物的弛豫时间T1为0.9～10.6 s，选择15 s作为定量，并用校正因子f=1.11校正延迟时间最长的化合物，得8种化合物的回收率为94%～100%，定量限为100 μmol/100 g。

3.2 磷酸盐分析检测

磷酸盐是食品工业常用的食品添加剂，可用作水分保持剂、膨松剂、酸度调节剂、稳定剂、凝固剂、抗结剂。常用的磷酸无机盐检测方法为离子色谱法，但该方法存在阴性离子干扰多、前处理复杂的缺点。

Sojka等[35]鉴别出市售三聚磷酸钠中含有焦磷酸钠、三偏磷酸钠、磷酸氢二钠3种杂质，并定量测出其含量，同时指出使用去耦脉冲序列可能会产生NOE效应，使核磁共振信号增强，造成定量结果偏大。Stanislawski等[24]在含有多种磷酸盐的混合溶液中添加顺磁试剂4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶酰氧基，缩短了各化合物的弛豫时间，猝灭了NOE效应，使用NMR采集时间2 h，定量测定了三偏磷酸钠、四偏磷酸钠、磷酸氢二钠、焦磷酸钠，其检出限为200 mg/kg。Belloque等[36]使用31P-qNMR测定了牛奶中的无机磷和磷酸丝氨酸，使用外标法定量，单个样品采集时间1.7 h，无机磷的线性范围为162～1 993 mg/kg，磷酸丝氨酸的线性范围为38～402 mg/kg，利用此方法测得牛奶中含有焦磷酸盐含量为58～576 mg/kg。Hrynczyszyn等[23]利用亚甲基二膦酸作为外标，利用硼酸—EDTA碱式缓冲液提取了肉制品中的4种磷酸盐KH2PO4, Na2H2P2O7, K4P2O7和Na5P3O10，其回收率为95%～99%，回收率变异系数≤5%；该方法具有良好的精密度，变异系数为0.39%～3.40%，试验发现利用水直接提取肉制品中磷酸盐的提取率较低(<90%)，使用缓冲盐提取的回收率较高。Szyk等[22]利用六甲基磷酰三胺作为内标试剂，使用硼酸-EDTA碱式缓冲液测定了肉制品中的4种磷酸盐Na2H2P2O7、K4P2O7、Na5P3O10、Na3P3O9，使用校正因子f校正HMPA和磷酸盐的磷原子响应当量，扫描参数为延迟时间5 s，扫描次数196，使用此方法的回收率为96.5%～98.0%，检出限为32 mg/kg，定量限为82 mg/kg。Kõllo等[6]以甲基膦酸作为内标物，对10种市售饮料中的磷酸盐进行了分析，饮料经NaOH固定pH值使其化学位移不发生变化，经直接上机测试，样本中的磷酸盐浓度为3.5～6.1 mmol/L。卢爱民等[37]建立了核磁共振磷谱(31P-NMR)快速测定可乐饮料中的磷酸根含量的定量分析方法，以磷酸二氢钾(KH2PO4)配制标准工作溶液，在0.25～4.00 mg/mL浓度范围内具有良好的线性关系。将该方法用于可乐中磷酸根含量的测定，测得可口可乐和百事可乐中的磷酸根含量分别为0.846 2，0.908 4 mg/mL，相对标准偏差分别为0.44%，0.46%，加标回收率分别为96.4%，109.7%。

3.3 功能成分的分析检测

植物中有效成分的确定一般包含提取、纯化及鉴定，鉴定常采用X晶体衍射、紫外及红外辅助定性，NMR技术则能确定化合物的构型及立体结构。Christophoridou等[38]使用亚磷酸化环己醇作为内标物，利用31P核磁共振波谱检测和定量酚类化合物，该方法利用衍生试剂2-氯-4,4,5,5-四甲基二氧磷杂环烷与酚类化合物的羧基进行衍生结合，根据31P化学位移识别亚磷酸化化合物，通过整合31P核磁共振波谱中的适当信号，可实现初榨橄榄油中大量酚类化合物的定量，该研究定量了20种酚酸，如邻香豆酸、对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸等；研究了不同温度下化学位移的改变，当温度为20～30 ℃时，化学位移偏移了2.0×10-8～6.0×10-8；利用顺磁物质乙酰丙酮铬的顺磁性降低了磷原子核的弛豫时间，从而缩短了检测时间。Crestini等[20]采用定量31P核磁共振和二维异核核磁共振波谱相结合的新分析方法，测定了儿茶、五味子和金合欢中原花青素的化学成分，以乙酰丙酮铬作为松弛剂，吡啶和氘代氯仿(V吡啶∶V氘代氯仿=1.6∶1.0)作为提取液，胆固醇作为内标，加入2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧磷烷作为衍生试剂，将样品在20 ℃下温浴60 min，上机测试，通过分析原花青素中黄烷-3-醇的A-、B-、C-环基团，鉴定出黄烷-3-醇单元的氧化模式，同时获取了原花青素样品的指纹图谱，并通过异核单量子关系(HSQC)技术测定了其纯度。Melone等[39]报道了一种前所未有的qNMR分析方法，该方法可以同时对单宁中的所有官能团进行结构和定量表征，使用2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧磷杂环烷引物原位标记所有不稳定的H基(脂肪族、酚羟基和羧酸)，使用31P-NMR定量测定其含磷官能团，为复杂的生物活性多酚化合物的结构鉴定和定量提供了可能。

3.4 有机磷农药检测

31P-NMR技术在有机磷化合物中应用广泛，包括有机磷农药抑制乙酰胆碱酯酶的机理、有机磷农药的毒性与分子结构关系、人体中有机磷农药代谢研究、有机磷农药的复合解毒剂研究、环境和食品中农药残留研究、有机磷在环境中的降解、有机磷在解毒剂中降解机理研究等[40]。Gurley等[41]利用31P-qNMR技术研究了有机磷农药，通过使用弛豫试剂减少扫描时间，25 min内的方法检出限为25 μg/mL。Mortimer等[42]使用31P-qNMR测定了10个西蓝花和卷心菜中的有机磷农药(二硫醚，二嗪酮，乐果、对硫磷、甲基叠氮磷)，以三苯基膦作为内标，延迟时间为1.0 s，扫描次数4 800次，其检出限达0.5 mg/kg。Krolski等[43]研究了二硫代磷酸酯类农药在土壤中的代谢，发现硫丙磷主要有硫丙磷亚砜和硫丙磷砜两种代谢产物，90 d后硫丙磷降解完全，转化为硫丙磷亚砜和硫丙磷砜，其含量分别为64%，36%。Talebpour等[44]利用六甲基磷酰三胺作为内标，用甲醇提取番茄中的敌百虫，并直接进行NMR定量分析，方法的检出限为55 mg/kg，重复性≤9.0%，平均回收率为99%～112%，31P-qNMR 技术解决了因敌百虫不稳定而造成气相色谱和液相色谱都不易测定的难题。Molaabasi等[45]以苯线磷和乙酰甲胺磷作为内标物质，使用NMR研究了环糊精对有机磷农药苯丙胺进行手性对映体的识别，两种手性对映体的化学位移分别为5.54×10-6，5.66×10-6，检出限分别为0.006 8，0.006 0 mg/mL，并以香蕉汁为对象进行加标回收试验，其回收率为94%～107%。Ansari等[19]建立了31P-qNMR同时检测水介质中4种有机磷农药(丙硫磷、溴苯磷、异柳磷、甲胺磷)的新方法，该方法的延迟时间为24 s，扫描次数为128～256次，内标为甲胺磷，其定量限为0.10～2.60 mg/L，加标回收率为82%～94%，相对标准偏差<4%，该方法简单、无基质干扰、选择性强、快速，可应用于其他样品基体。周霞云[16]利用磷酸三苯酯作为内标，使用qNMR定量测定毒死蜱和甲基对硫磷，两种化合物的加标回收率分别为87.25%～92.70%，79.8%～93.1%，相对标准偏差分别为0.90%～2.46%，0.85%～1.56%。Belmonte-Sánchez等[46]利用31P-qNMR 定量测定了蔬菜中洗涤剂羟基亚乙基二膦酸(HEDP)，使用Na2HPO4作为内标校正，HEDP的线性范围为0.01%～0.05%，延迟时间为0.01 s，扫描时间为1 min 时方法的检出限为0.017%，扫描时间为60 min时的检出限为0.003%，方法的加标回收率为95.0%～105.4%，10种蔬菜洗涤液中HEDP含量为0.003%～0.050%。

3.5 化合物纯度及不确定度评价

NMR被广泛应用于食品分析用标准品纯度及不确定度评价、农药纯度鉴定等领域。Greenhalgh等[47]使用磷酸三苯酯作为内标，使用乙酰丙酮铬作为顺磁试剂测定了11种工业级有机磷杀毒剂的纯度和主要杂质含量。Al-Deen等[4]以磷酸钠作为内标物质测定草甘膦和丙溴磷纯度，使用1H-NMR 测得草甘膦纯度为97.07%，σ= 0.68，使用31P-qNMR测其纯度为96.53%，σ= 0.90；使用1H-NMR测得丙溴磷纯度为94.63%，σ= 0.14，使用31P-NMR 测其纯度为94.62%，σ= 0.59。Al-Deen等[48]使用31P-qNMR法测定了草甘膦纯度的不确定度，单次测定纯度的扩展不确定度为0.82%(95%置信区间，k=2)。Shamsipur等[21]使用磷酸作为内标，用31P-qNMR检测敌百虫、毒死蜱、杀螟松、二嗪农、草甘膦5种有机磷农药纯度，其线性范围为25～300 mg/L，前4种农药检出限为3 mg/L，草甘膦检出限为16.3 mg/L，分析结果与气相色谱仪检测结果无显著性差异，使用该方法不需要任何前处理，方便简洁，可快速测定农药中的有效纯度。卢爱民等[49]以重水为溶剂、磷酸二氢钾为内标，以化学位移δ0.017，δ41.86作为定量峰，根据公式计算出草铵膦原药的有效成分含量，测得同一批次原药中有效成分含量平均值为98.73%，相对标准偏差为0.18%，此方法简单、快捷，不需要待测组分标准品，可用作一些特殊样品的定性定量分析。Weber等[50]使用同时含有H和P原子的磷酸三苯酯，以有证标准物质(CRM)磷酸三苯酯为内标，用31P-qNMR法测得磷酸三(2-氯乙基)磷酸酯纯度为(98.43±0.66)%，以膦乙酸作为内标测其纯度为 (98.45±0.44)%。分别使用磷酸三苯酯和膦乙酸作为内标，以1H-qNMR作为定量，其纯度分别为(98.41±0.53)%，(98.88±0.52)%。使用31P-NMR的图谱简单、定量分析快速，是一种很有前途的纯度测定方法。

4 结论及展望

定量核磁共振磷谱技术不需要待测物的标准品即可完成对未知物的定量分析，原理易懂、前处理简单、准确度高，被广泛应用于食品活性磷脂检测、磷酸盐检测、有机磷农药检测、生物活性物质检测及标准品纯度鉴定等方面，是一种强大的分析工具。但是定量核磁共振磷谱也存在一定的缺陷，比如灵敏度不高，对微量成分进行准确定量仍存在难度，需进一步开发适合31P检测的高灵敏度的探头；并且核磁共振设备的普及率远不及其他色谱仪器，从而限制了这项技术的广泛应用。但是随着科技的发展量核磁共振技术必将会迎来广阔的应用前景。