基于小热休克蛋白-细胞穿膜肽蛋白纳米粒的siRNA递送系统

王 浩，刘 宁，陈 丽，崔梅英，王冬梅，刘宇轩，关新刚

(北华大学 医学技术学院，肿瘤靶向治疗重点实验室，吉林 吉林 132013)

小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)因其为可靶向沉默细胞内的特异性基因，在药物研发领域已引起人们广泛关注[1-5]. 但siRNA体内半衰期短、 易降解、 穿膜性差等缺点限制了其在体内的进一步应用[6-8]. 设计开发高效、 安全的siRNA递送体系成为发挥siRNA治疗功效的关键因素.

近年来，基于蛋白质[9]、 脂质体[10-11]、 高分子聚合物[12-13]、 无机材料[14]等多种材料的递送系统已用于siRNA高效率转运的研究中，其中基于蛋白质材料的siRNA递送系统因蛋白质材料具有良好相容性和可降解性及可通过基因工程改造等特性已引起人们广泛关注[15-17]，基于病毒衣壳蛋白的siRNA递送体系可高效率地递送，但需考虑载体蛋白的安全性[18]. 非病毒类的蛋白纳米笼由于高稳定性、 单分散性、 良好的生物相容性和生物降解性，广泛用于构筑多功能的药物递送系统中，在肿瘤靶向诊断和治疗方面取得了重要进展[19]. 小热休克蛋白(heat shock protein，Hsp)的蛋白纳米粒可承受高pH值和高温等环境，其笼内腔可用于包裹抗癌药物、 光敏剂和成像剂，笼外表面可修饰功能肽，显示出作为递送载体的巨大潜力[20]. 源自詹氏甲烷球菌的Hsp因其24个亚基可自组装成粒径均一的空心笼状结构(外径13 nm，内径6.5 nm)而广泛用于递送各种药物和成像分子中[21]. Tat是人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因编码的反式转录激活因子，作为经典的细胞穿膜肽(cell penetrating peptide，CPP)被广泛用于各种物质的胞内转运中[22-24]. 本文通过在Hsp基因C末端引入Tat序列，表达纯化Hsp-Tat融合蛋白，制备Hsp-Tat纳米粒，研究其生物相容性、 siRNA复合及siRNA胞内转运特性，为高效、 安全的新型siRNA递送系统研究提供依据.

1 材料与方法

1.1 质粒、 细胞和主要试剂

pET-25b-Hsp-Tat质粒由上海生工公司构建; 大肠杆菌BL21(DE3)和HEK-293T细胞由北华大学肿瘤靶向治疗重点实验室保存; 酵母提取物和蛋白胨、 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、 苯甲基磺酰氟(PMSF)、 氨苄青霉素(Ampicillin)和Ni-NTA亲和树脂(生工生物工程(上海)股份有限公司)； DAPI(4′，6-二脒基-2-苯基吲哚)、 DiO(细胞膜绿色荧光探针)和蛋白质标准品(上海碧云天生物技术有限公司)； 活/死细胞活力检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)； Lipo 3000转染试剂(美国Invitrogen公司)； siRNA及Cy3标记的siRNA(siRNA为不靶向任何基因的阴性对照序列，上海吉玛制药技术有限公司)，正向序列: UUCUCCGAACGUGUCACGUTT; 反向序列: ACGUGACACGUUCGGAGAATT.

1.2 Hsp-Tat融合蛋白的原核表达与纯化

将pET-25b-Hsp-Tat质粒转化入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，菌液均匀涂布于LB(Luria-Bertani)固体培养基(含Ampicillin)上，于37 ℃温箱培养过夜. 挑取单克隆菌落接种于LB培养基中，于37 ℃振荡培养过夜; 第二天按1∶100比例于LB培养基中扩大培养，当菌液OD600=0.5～0.6时，加入IPTG(终浓度1 mmol/L)继续诱导6 h. 培养结束后离心收集菌体，重悬后超声破碎菌体，离心收集菌体裂解液. 用结合缓冲液平衡预装柱中Ni-NTA树脂后，加入2倍柱体积的菌体裂解液，于杂交炉4 ℃孵育1 h后收集穿流液，然后加入洗涤缓冲液洗去非特异性结合蛋白，再加入洗脱缓冲液洗脱收集目的蛋白，重复洗脱3次收集洗脱液; 对裂解液的上清液、 穿流液、 洗涤产物和洗脱产物进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测(POWERPAC型，美国Bio-Rad公司).

1.3 Hsp-Tat纳米粒的表征

用纳米粒度分析仪(Nanotrac Wave Ⅱ型，美国Microtrac公司)测定纯化后Hsp-Tat的粒径，在测量前将融合蛋白样品振荡混匀，用0.45 μm PES(聚醚砜)针头过滤器过滤，取200 μL样品加入分析仪测量孔测量. 用场发射透射电镜(JEM-1011型，日本JEOL公司)检测纳米粒形貌，加速电压为100 kV.

1.4 Hsp-Tat NP的生物相容性

将HEK-293T细胞于培养皿中培养，加入含体积分数为10%的胎牛血清(FBS)、 100 μg/mL的青霉素和青链霉素的DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培养基，于φ(CO2)=5%，37 ℃细胞培养箱中孵育. 将HEK-293T细胞以5×103/孔铺于96孔板上，24 h后将终质量浓度分别为12.5，25，37.5，50，100 μg/mL的Hsp-Tat融合蛋白加入孔板中，每个质量浓度设置5个复孔，孵育48 h. 每孔加入20 μL MTT(噻唑蓝，5 mg/mL)孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO(二甲基亚砜)，在酶标仪(Spark 20M型，瑞士TECAN公司)上测量其在490 nm处的吸光度，检测结果以均值±SD(标准差)表示. 将HEK-293T细胞以5×103/孔铺于96孔板上，孵育24 h后加入100 μg/mL的Hsp-Tat融合蛋白，继续培养48 h，弃上清液后用PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤2次，加入活/死细胞活力检测试剂，用激光共聚焦荧光显微镜(Axio Imager A2型，德国Zeiss公司)成像.

1.5 Hsp-Tat NP的siRNA复合特性

将Hsp-Tat NP与siRNA按n(Hsp-Tat NP)∶n(siRNA)(N/P)=0,0.39,0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50混合在pH=7.4的PBS缓冲液中，于37 ℃孵育1 h，在体积分数为2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析仪(BDAdigital型，德国耶拿公司)观察并扫描成像.

1.6 Hsp-Tat NP/siRNA复合物的稳定性

用纳米粒度分析仪(Nanotrac Wave Ⅱ型，美国Microtrac公司)连续7 d监测Hsp-Tat NP/siRNA复合物(N/P=50)在0.1 mol/L PBS(pH=7.4)分散体系中的粒径，每份样品平行操作3次，检测结果以均值±SD表示.

1.7 细胞转染实验

用荧光素(Cy3)标记的siRNA检测Hsp-Tat NP的siRNA胞内转染特性. 将对数生长期的HEK293T细胞接种于具小圆盖玻片的24孔板中培养24 h. 第二天将20 pmol Cy3-siRNA 与34 μg Hsp-Tat NP按N/P=50进行复合，于37 ℃孵育1 h制备Hsp-Tat NP/siRNA复合物. 以无递送载体的20 pmol Cy3-siRNA为阴性对照，将20 pmol Cy3-siRNA和1 μL Lipo3000转染试剂分别与25 μL Opti-MEM混匀，于室温混合孵育15 min制备Lipo3000/siRNA复合物作为阳性对照. 在孔板中分别加入20 pmol游离siRNA、 按上述方法制备的Lipo3000/siRNA复合物及Hsp-Tat NP/siRNA复合物，于37 ℃孵育4 h后，将孔中培养基替换为含血清的完全培养基，继续培养24 h. 然后用PBS洗涤细胞2次，并在室温下用质量分数为4%的多聚甲醛固定20 min，DiO染色5 min，DAPI染色10 min，PBS冲洗3次. 将染色的盖玻片倒置于载玻片上，封片后用激光共聚焦荧光显微镜成像.

2 结果与分析

2.1 Hsp-Tat 融合蛋白的原核表达与纯化结果

将Hsp-Tat质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，IPTG诱导6 h后收集细菌，超声破碎，离心收集裂解液上清液和沉淀. Hsp-Tat蛋白原核表达及纯化的SDS-PAGE分析如图1所示. 由图1可见，Hsp-Tat融合蛋白主要以可溶性蛋白分布于菌体裂解液上清液(泳道CL)中，为后续利用亲和层析柱方法纯化蛋白创造了有利条件. 由于Hsp-Tat融合蛋白末端携带组氨酸标签，因此选用Ni-NTA树脂纯化蛋白. Ni-NTA树脂的3次洗脱液(泳道E1,E2,E3)均检测到纯度较高的单一条带，相对分子质量与预期相符(25 760)，表明Hsp-Tat融合蛋白制备成功.

CL: 细菌裂解液； FT： 上样穿流液； W： 洗涤缓冲液；E1～E3： 洗脱缓冲液1～3； M： Marker.图1 Hsp-Tat蛋白原核表达及纯化的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression and purification of Hsp-Tat protein

2.2 Hsp-Tat蛋白纳米笼粒径的表征结果

由于24个Hsp单体亚基可自组装成直径为20 nm的空心笼形结构[25]，因此本文检测了Hsp-Tat融合蛋白的自组装特性. Hsp-Tat蛋白纳米笼粒径的分布与透射电镜(TEM)照片如图2所示. 由图2(A)可见，Hsp-Tat融合蛋白自组装纳米颗粒(Hsp-Tat NP)的平均粒径为40.2 nm； 由图2(B)可见，蛋白纳米颗粒为空心球形结构，与文献[17]中Hsp衍生蛋白自组装成笼形纳米结构一致. 与Hsp纳米颗粒相比，Hsp-Tat NP的粒径稍大，推测较大粒径可能与Hsp-Tat融合蛋白C末端引入较多的氨基酸有关.

图2 Hsp-Tat蛋白纳米笼粒径的分布(A)和TEM照片(B)Fig.2 Size distribution (A) and TEM image (B) of Hsp-Tat protein nanocages

2.3 Hsp-Tat NP的生物相容性结果

用MTT法和活/死细胞染色法检测Hsp-Tat NP在HEK-293T细胞的生物相容性，结果如图3所示. 由图3(A)可见，当Hsp-Tat NP蛋白质量浓度为100 μg/mL时，细胞生存率仍接近100%; 由图3(B)可见，在纳米粒蛋白质量浓度为100 μg/mL处理48 h后，仅检测到极少数死细胞(红色)，绝大多数细胞生长状态良好(绿色)，表明Hsp-Tat NP具有良好的生物相容性.

图3 Hsp-Tat NP的HEK-293T细胞生物相容性Fig.3 Biocompatibility of Hsp-Tat NP on HEK-293T cells

2.4 Hsp-Tat NP的siRNA复合特性结果

由于引入的Tat序列中含有丰富的精氨酸，因此推测Hsp-Tat NP可通过静电吸附作用与负电荷核酸形成复合体结构. 通过凝胶阻滞实验检测Hsp-Tat NP的siRNA复合特性, 结果如图4所示. 由图4可见，随着NP/siRNA 比例逐渐增加，siRNA在泳道中的迁移速度越来越慢，在比例为50时达到完全阻滞. 表明所有siRNA与带正电荷的Hsp-Tat NP形成紧密的NP/siRNA复合物，彻底阻滞了siRNA在泳道中的迁移. 本文达到彻底阻滞效果的N/P比较高，这是由于Hsp-Tat融合蛋白中Hsp参与纳米笼结构的组装，其中正电荷氨基酸不能有效复合siRNA，融合蛋白中仅Tat序列中的正电荷氨基酸参与siRNA复合，导致凝胶阻滞N/P比较其他体系略高.

a～i: N/P=0,0.39,0.78,1.56,3.13,6.25,12.5,25,50.图4 Hsp-Tat蛋白纳米笼siRNA 复合后的凝胶阻滞实验结果Fig.4 Experimental results of gel retardation of Hsp-Tat NP/siRNA complexes

2.5 Hsp-Tat NP/siRNA复合物的稳定性结果

通过粒径变化检测Hsp-Tat NP/siRNA复合物体外稳定性, 结果如图5所示. 由图5可见，7 d内Hsp-Tat NP/siRNA复合物在PBS中分散较好，复合物粒径均未发生明显变化(约55.1 nm)，表明蛋白纳米粒与siRNA形成的复合体在体外具有良好的稳定性. Hsp-Tat NP/siRNA复合物粒径较Hsp-Tat NP(40.2 nm)明显增大，这是由于纳米粒表面的正电荷氨基酸通过静电吸附siRNA，使复合物粒径增大所致.

图5 Hsp-Tat NP/siRNA复合物的稳定性Fig.5 Stability of Hsp-Tat NP/siRNA complexes

2.6 Hsp-Tat NP的siRNA转染

在Hsp-Tat NP与siRNA高效复合的基础上研究其siRNA转染能力. 为便于检测和追踪，用红色荧光染料Cy3标记的siRNA(Cy3-siRNA)进行转染实验, 结果如图6所示. 由图6可见，在游离siRNA组(阴性对照)胞内未检测到红色荧光，在阳性脂质体组(阳性对照)和Hsp-Tat NP组细胞中均观察到明显的红色荧光，红色荧光广泛分布在细胞质中，表明Cy3-siRNA被Hsp-Tat NP成功转运至HEK-293T细胞的细胞质中.

图6 Hsp-Tat NP 在HEK-293T细胞的siRNA转染效果Fig.6 siRNA transfection effects of Hsp-Tat NP on HEK-293T cells

可见，本文制备的Hsp-Tat纳米粒作为siRNA新型递送载体，与已报道的其他Tat递送系统相比具有如下优势:

1) Tat序列用基因工程方法插入Hsp基因序列C末端，通过表达纯化融合蛋白直接得到了自组装Hsp-Tat纳米粒，而不是将Tat肽通过繁琐的化学方法修饰到纳米颗粒上[26-31];

2) Hsp-Tat纳米粒将Hsp纳米笼极佳相容性和可降解性、 耐受恶劣环境等特性与Tat肽快速內吞或高效复合siRNA二者有机结合，构筑安全、 高效的新型siRNA纳米递送系统.

综上所述，本文制备了基于Hsp-Tat纳米粒的新型siRNA递送体系，该纳米粒具有良好的生物相容性及高效siRNA复合特性，可将siRNA高效递送进入细胞内. Hsp-Tat纳米粒作为一种安全高效的非病毒siRNA递送载体，具有广阔的应用前景.