精氨酸对冷应激腹泻仔猪肠道结构和功能的影响

苟昌勇，施晓丽*，班明政,2，孙澄慧，石 靖，张友平

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.贵州农业职业学院，贵州贵阳 551400；3.开阳农业农村局，贵州贵阳 550300）

仔猪腹泻发病率在10%～20%，甚至高达46.5%[1-2]，给养猪生产造成了巨大损失。影响仔猪腹泻的病因复杂，其中畜舍低温冷应激导致的腹泻在生产中频发[1,3]。腹泻往往导致仔猪肠道结构损伤和功能紊乱，而肠道功能紊乱是当前危害仔猪健康与生长的核心问题[4]。许多研究表明，精氨酸（Arg）及其代谢产物一氧化氮（NO）在许多生理和病理状态中起着调节细胞功能的作用[5-6]，适宜Arg 可促进仔猪肠道发育[5-10]。但较少研究冷应激导致的腹泻状态下，Arg 是否可修复仔猪肠道及其适宜添加水平。本试验拟探讨Arg 水平对腹泻仔猪小肠吸收、肠道结构和发育的影响，确定仔猪在腹泻条件下适宜的Arg 水平，以减少仔猪断奶应激，促进仔猪生长，为提高养猪生产效益提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料L-精氨酸（医药级，98.5%）、L-丙氨酸（医药级，98.5%）、L-甘氨酸（医药级，98.5%）均购自武汉富驰生物科技有限公司，其他饲料原料购自贵阳新希望饲料有限公司。

1.2 试验设计及饲养管理 试验采用单因子试验设计，选择体重约6.5 kg、在低温（20℃±3℃）环境下饲养2～3 d 的28 日龄断奶仔猪，挑出中等腹泻（参照Kelly等[11]仔猪腹泻评分标准，中等腹泻的粪便稠状不成形，粪水未分离，粪便评分2 分）大约克仔猪24 头，于试验第1 天任选3 头颈静脉采血后屠宰取肠道样品，然后将剩下的21 头分成3 组，参照NRC（1998）5～10 kg 猪营养需要，配制基础饲粮（表1），各组饲粮Arg 水平分别为1.1%、1.4% 和1.7%，同时添加丙氨酸和甘氨酸（1:1）以保证各组饲粮等氮，添加比例分别为1.0%、0.6%和0.30%。仔猪单栏饲养，舍内温度保持在25～28℃，保温箱保温。每天于08:00、12:00、16:00 和20:00 投料，自由采食和饮水。每天观察记录仔猪腹泻和死亡情况。饲养试验全期14 d。

1.3 样品采集

1.3.1 血液样品采集及处理 试验开始第1 天选取3 头、第14 天每组分别任选3 头，分别在第1 天和第14 天按1 mL/kg 体重灌服10%（体重/体积）D-木糖1 h 后，前腔静脉采血5 mL，置于加有肝素钠的真空管中，静置15 min，然后3 000 r/min、4℃离心20 min 取血浆3份，存于-80℃备用待测。

1.3.2 肠道样品采集及处理 采血后，戊巴比妥钠麻醉后，迅速剖开腹腔取小肠，排尽食糜。十二指肠距胃幽门5 cm 处取样，从空肠中段和回肠中段截取10 cm，用预冷生理盐水冼净肠段，剪取2 cm 置于10%中性甲醛中固定，用于组织形态学观察。剩余肠段用滤纸吸干水分，用剪刀的钝面刮取肠黏膜，分装到5 mL 冻存管中，立即放入液氮中速冻，转移至-80℃冰箱中保存待测。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 十二指肠、空肠和回肠组织形态学观察 肠道固定样品经脱水、包埋、切片、伊红-苏木精染色等处理后，用Olympus C011 显微镜观测其形态结构，扫描切片，用CaseViewer 3.2 软件测量绒毛高度和隐窝深度，每个样本观察3 个非连续切片，每张切片选取3 个视野，每个视野测定10 个绒毛长度和隐窝深度，其平均值作为1 个测定数据。

1.4.2 肠道发育指标 肠道黏膜蛋白质含量采用Bradford的考马斯亮兰法测定，以牛血清白蛋白为标准。肠道黏膜DNA 浓度用紫外可见分光光度法测定，RNA 浓度通过测定232 nm 和260 nm 处的吸光度值，用F1eck-Begg 公式算出。DNA、RNA 和蛋白质浓度分别乘以黏膜重量即得DNA、RNA 和蛋白质在肠黏膜中的总量。血浆D-木糖含量采用间苯三酚比色法测定。肠黏膜NO 含量采用硝酸还原酶比色法测定；肠黏膜一氧化氮合成酶（NOS）含量采用NOS 催化Arg 比色法测定。上述试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

表1 基础饲粮组成及其营养成分

1.5 统计分析 采用SPSS 18.0 统计软件分析试验数据，采用One-Way ANOVA 进行单因素方差分析和Duncan's多重比较，试验结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 Arg 水平对腹泻仔猪肠道形态的影响 由表2 可见，1.4%Arg 组仔猪十二指肠绒毛高度分别比1.1%Arg 组、1.70%Arg 组和试验起始组提高70.99%、65.69% 和90.35%（P＜0.01），但1.1%Arg 组、1.7%Arg 组和试验起始组间无显著差异；添加Arg 亦可提高腹泻仔猪空肠和回肠绒毛高度（P＜0.05），虽然Arg 水平间无显著差异，但仔猪在摄入1.4%Arg 组饲粮时其回肠（P=0.068）和空肠绒毛长度均有提高趋势（P=0.073）；而Arg 水平对十二指肠、空肠和回肠隐窝深度均无显著影响；随着Arg 水平提高，十二指肠和空肠的绒毛高度/隐窝深度随之提高，以1.4%Arg 组水平为最高；Arg 水平对回肠的绒隐比影响也呈相同趋势，以1.70%Arg 组为最高，但1.4%Arg 组和1.70%Arg 组间无显著差异。表明饲粮中添加适宜Arg 促进腹泻仔猪肠道功能的恢复。

2.2 Arg 水平对腹泻仔猪肠道发育的影响 由表3 可见，采食1.1%Arg 组和1.4%Arg 组饲粮仔猪血浆木糖含量高于1.7%Arg 组和腹泻起始组（P＜0.01），表明适宜Arg 水平促进仔猪肠道的吸收，过高不利于改善冷应激下仔猪肠道健康。十二指肠、空肠和回肠蛋白、DNA和RNA 含量均随着Arg 水平提高而提高，Arg 水平为1.4%时达到最大值，增加至1.7%水平却显著或极显著降低。而仔猪十二指肠、空肠和回肠中NO、总一氮化氮合成酶（TNOS）及诱导型一氮化氮合成酶（iNOS）均随着Arg 水平提高而提高（P＜0.01）。

3 讨 论

3.1 Arg 对肠道吸收和肠道结构的影响 仔猪腹泻导致仔猪消化道组织学和形态结构的损伤性变化[4,12-13]、肠道结构形态的变化，直接影响着仔猪肠道的消化和吸收功能[14]。当肠道黏膜形态结构受损，D-木糖吸收降低，血浆D-木糖含量亦随之降低，木糖吸收试验是研究小肠吸收功能的重要评价方法[4]。本试验结果表明，随Arg 水平提高，仔猪血浆D-木糖含量显著上升，以1.4%Arg 水平的D-木糖含量最高，但Arg 水平升至1.7%时，D-木糖含量显著降至腹泻起始水平，表明1.4%Arg 可改善肠道黏膜吸收功能，过高则不利于肠道吸收。小肠形态指标变化支持这一点，绒毛高度和绒隐比与血浆D-木糖含量间平行，绒毛越高，绒隐比越大，血浆D-木糖含量越高。给缺血和内毒素作用损害肠道功能的大鼠饲喂Arg 水平饲粮，同样可减轻肠道黏膜损伤，改善肠道黏膜吸收功能[15-16]。采食1.52% Arg 饲粮的14 日龄断奶仔猪小肠肠绒毛高度明显提升，十二指肠和空肠隐窝深度降低，当Arg 增加至2.02% 时，小肠各段绒毛高度降至0.8%Arg 水平[17]。黄晶晶[8]用脂多糖攻击仔猪的试验显示，1.76%～2.26% Arg 可缓解应激仔猪肠道细胞的凋亡，刺激肠细胞的增殖，表明适宜Arg 可促进肠道上皮生长分化，维持肠黏膜的完整和吸收功能[15]。研究发现，7 日龄断奶仔猪适宜Arg 为1.41%～1.61%[18]，而21～28 和28～35 日龄的适宜Arg则分别1.17% 和0.97%[9,16]，表明仔猪年龄越小，Arg需要量越高。田一航等[10]报道低体重仔猪的Arg 需要量高于正常体重仔猪。本试验冷应激中等腹泻仔猪的适宜Arg 为1.4%。曲红炎[3]试验虽未给出基础饲粮Arg营养水平，但结果表明添加0.8%～1.2% Arg 可提高冷应激仔猪增重和免疫力。上述研究表明，仔猪日龄、体重和脂多糖应激影响维持仔猪肠道生长或缓解肠道损伤的Arg 需要，但现有研究较少关注生产中冷应激腹泻及其程度与Arg 的供求关系。本试验只显示，中等腹泻28～42 d 仔猪饲喂1.4%Arg 饲粮可修复腹泻仔猪小肠的形态结构和维持吸收功能。而轻度或重度腹泻仔猪Arg需要在不同体重日龄是否有变化，则有待于进一步研究。因挑选腹泻程度、体重和年龄均相近的仔猪较为困难，试验设计不尽合理，试验动物较少，有必要增大样本容量，以进一步验证Arg 对腹泻仔猪肠道的调节作用。

表2 Arg 水平对腹泻仔猪小肠形态结构的影响

表3 Arg 水平对腹泻仔猪小肠吸收和黏膜发育的影响

3.2 Arg 对肠道功能的调节 肠道黏膜DNA、RNA 和蛋白质是小肠细胞生长和修复的基础，蛋白质和DNA含量增加意味着小肠细胞合成代谢加快[8,15-17]。研究发现，Arg 缺乏，动物机体DNA、RNA 和蛋白质合成速率会大幅度降低[19]，添加Arg 显著提高回肠黏膜DNA和蛋白质含量[15]。本试验结果显示，提高Arg 水平极显著刺激仔猪各肠段黏膜DNA、RNA 和蛋白合成，仔猪肠道绒毛高度与黏膜DNA、RNA 及蛋白含量间有极好的平行性，说明Arg 是通过促进肠道黏膜生长来缓解腹泻对仔猪肠道的损伤。黄晶晶[8]试验亦证实添加Arg可增加脂多糖攻击仔猪小肠黏膜蛋白质和DNA 含量，减轻肠道应激。许多研究探讨了Arg 参与肠道功能调节的途径，认为Arg 可能是通过其代谢产物多胺或鸟氨酸参与DNA 合成，增加肠黏膜蛋白质[20-22]。Arg 也可通过提高NO 含量清除部分氧自由基，减轻肠黏膜脂质过氧化损害，缓解黏膜蛋白质合成的减少，促进小肠康复[18,23]。NO 在NOS 催化下由Arg 氧化分解产生[5-6]。神经型NOS（nNOS）和内皮型NOS（eNOS）常规表达，间歇催化生成低水平NO，以维持细胞正常功能；细胞因子和内毒素激活诱导型NOS（iNOS），iNOS 可加强或消除各种炎症反应，在许多疾病条件下iNOS 可加剧机体组织的受损程度[5-6]。许多研究亦表明，提高Arg可增加iNOS 活性，促进NO 生成，适宜NO 产量促进肠道发育恢复，过高则加剧肠道损伤[6-7,12,23]。本试验结果显示，NO 含量不仅与TNOS 和iNOS 活性相关，也与Arg 水平正相关，但肠绒毛高度、蛋白质、DNA 和RNA 含量则在1.4%Arg 水平达到最高后又下降，表明过高Arg 有损肠道修复，抑制仔猪生长[24]。

4 结 论

本研究结果表明，适宜Arg 水平有利于腹泻仔猪修复肠道结构和功能，过高Arg 加剧肠道损伤，冷应激中等腹泻仔猪适宜Arg 水平为1.4%；Arg 可能通过提高NOS 活性，产生适量NO，促进肠道DNA、RNA 和蛋白质合成，修复肠道结构和功能。然而本研究中试验动物较少，需增大样本容量，进一步验证Arg 对肠道调节作用和适宜水平，以利于在实际生产中科学合理应用。