亚低温联合氯丙嗪对脑缺血再灌注损伤大鼠氧化应激反应的影响

吴志殿，谢承志，黎金国，吴维雄，于 航

脑缺血一定时间再恢复血供，其功能不仅未恢复，同时出现严重功能障碍，临床称为脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)，随着动脉溶栓技术在急性脑梗死治疗中的广泛开展，CIRI的有效防治是决定急性脑梗死病人预后的关键因素[1]。脑缺血发生后，亚低温通过多种途径发挥脑保护作用[2]，氯丙嗪属于吩噻嗪类抗精神病药物，可阻断大脑皮层多巴胺受体，抑制体温调节中枢，降低体温，阻断外周α-肾上腺素受体，扩张血管[3]；有研究显示，亚低温联合吩噻嗪类药物治疗急性脑缺血可获得显著疗效[4]。本研究观察亚低温联合氯丙嗪对CIRI大鼠氧化应激反应的影响及神经保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，购自海南医学院动物实验中心，实验动物许可证号：SCXK(琼)2018-0012。温度22℃，湿度56%，自由饮水，进食条件下适应性喂养1周。

1.2 实验试剂与仪器 氯丙嗪购自常州康普药业有限公司，神经元特异性烯醇酶(NSE)、S-100β蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，NF-E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶(HO-1)、β-actin抗体购自美国proteintech公司，蛋白裂解液购自北京普利莱公司，Super ECL Plus超敏发光液购自美国Thermo pierce公司，电泳槽、转膜仪购自北京六一仪器厂，数位温度表购自中国台湾泰仕电子工业股份有限公司，大鼠肛温温度计购自北京冀诺泰科技发展有限公司，MIAS医学图像分析系统购自北航公司。

1.3 动物分组和造模 将75只SD大鼠采用数字表法随机分为假手术组、CIRI组、亚低温组、氯丙嗪组和亚低温联合氯丙嗪组，每组15只。参照涂献坤等[5]报道的方法制作CIRI模型，假手术组只暴露颈总动脉，不进行阻断处理；CIRI组暴露颈总动脉后，使用动脉夹关闭颈总动脉90 min后松开，观察恢复血供后缝合皮肤；亚低温组先给予冰袋诱导低温，之后再进行CIRI造模，造模过程中大鼠肛温(肛温温度计插入大鼠肛门测定)应降至(33±1)℃、鼓膜温度降至(31±1)℃，持续亚低温12h；氯丙嗪组先给予氯丙嗪(生理盐水稀释0.25 mg/mL，1.0 mg/kg)尾静脉注射，之后再进行CIRI造模；亚低温联合氯丙嗪组先给予亚低温处理和静脉注射氯丙嗪，之后再进行CIRI造模。24 h后进行相关功能和实验室检查。

1.4 神经功能检查 使用神经功能损伤评分(neuro-logical deficit scoring，NDS)评价各组大鼠神经功能变化，0分为无神经功能缺损，1分为前肢无法伸展，2分为前肢无法承受身体重量，3分为肢体无自发活动，4分无意识。

1.5 实验室检查 应用酶联免疫吸附法检测NSE和S-100β蛋白表达水平，化学比色法检测SOD，硫代巴比妥酸比色法检测MDA。24 h后断头处死大鼠，取缺血区脑组织，加入1mL生理盐水置于冰上匀浆，以1 500 r/min离心10 min，取上清液待测，严格按照试剂盒说明书操作，加入相关试剂，根据吸光度值，对应标准品计算各指标样品的表达水平。

1.6 Western Blotting检测Nrf2和HO-1蛋白 缺血区脑组织加入1 mL生理盐水置于冰上匀浆，以1 500 r/min离心10 min，取50 mg沉淀加入蛋白裂解液，提取细胞总蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂奶粉封膜后加入Nrf2(1∶1000稀释)、HO-1(1∶1000稀释)或β-actin(1∶5000稀释)一抗孵育过夜，洗膜后加入二抗室温孵育2 h，Super ECL Plus超敏发光液显示条带，应用MIAS医学图像分析系统扫描条带并计算各蛋白相对灰度值。

2 结 果

2.1 亚低温联合氯丙嗪对CIRI大鼠神经功能的影响 亚低温组、氯丙嗪组和亚低温联合氯丙嗪组NDS评分及NSE、S-100β蛋白表达水平均低于CIRI组(P<0.05或P<0.01)；亚低温联合氯丙嗪组NDS评分及NSE、S-100β蛋白表达水平均低于亚低温组和氯丙嗪组(P<0.05)。详见表1。

表1 5组NDS评分和NSE、S-100β蛋白表达水平比较(±s)

2.2 亚低温联合氯丙嗪对CIRI大鼠氧化应激反应的影响 亚低温组、氯丙嗪组和亚低温联合氯丙嗪组SOD水平均高于CIRI组(P<0.05或P<0.01)，MDA水平均低于CIRI组(P<0.05或P<0.01)；亚低温联合氯丙嗪组SOD水平均高于亚低温组和氯丙嗪组(P<0.05)，MDA水平均低于亚低温组和氯丙嗪组(P<0.05)。详见表2。

表2 5组SOD和MDA水平比较(±s)

2.3 亚低温联合氯丙嗪对CIRI大鼠Nrf2和HO-1蛋白表达的影响 亚低温组、氯丙嗪组和亚低温联合氯丙嗪组Nrf2和HO-1蛋白相对灰度值均高于CIRI组(P<0.01)；亚低温联合氯丙嗪组Nrf2和HO-1蛋白相对灰度值均高于亚低温组和氯丙嗪组(P<0.01)。详见表3、图1。

表3 5组Nrf2和HO-1蛋白相对灰度值比较(±s)

图1 5组Nrf2和HO-1蛋白表达的Western Blotting图像

3 讨 论

长期以来，物理低温认为是一种有应用前景的保护缺血性脑卒中神经的治疗方法[6]，亚低温对缺血再灌注的保护作用研究已有数十年[7]。李丽茹等[8]研究显示，亚低温可抑制脑缺血再灌注后自噬蛋白表达，改善模型大鼠认知障碍。刘剑等[9]研究显示，亚低温可抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路保护肝脏缺血再灌注损伤。氯丙嗪是常用的吩噻嗪类抗精神病药物，由于其高亲脂性，易通过血脑屏障，产生人工冬眠的效果，氯丙嗪可促进血管舒张并抑制颤抖，从而平稳快速地下降体温，还可抑制缺血时线粒体通透性，减轻缺血损伤[10]。

本研究使用亚低温联合氯丙嗪防治脑缺血再灌注损伤，结果发现亚低温联合氯丙嗪组NDS评分低于亚低温组和氯丙嗪组。NSE和S-100β蛋白是神经元胞质中的特异性蛋白，脑损伤时从细胞内释放到血液中，本研究结果显示，亚低温联合氯丙嗪组NSE和S-100β蛋白表达均低于亚低温组和氯丙嗪组，说明联合治疗可降低CIRI大鼠脑损伤，并发挥神经保护作用。

氧化应激激活认为是缺血脑组织恢复血供后损伤的主要机制[11]，MDA是氧化应激反应的终末产物，SOD可参与氧自由基清除，拮抗氧化应激[12]。本研究结果显示，亚低温联合氯丙嗪组SOD高于亚低温组和氯丙嗪组，而MDA低于亚低温组和氯丙嗪组组，说明亚低温联合氯丙嗪治疗可减低缺血再灌注脑组织的氧化应激反应。Nrf2/HO-1是人体内重要的氧化应激调控通路，Nrf2调控下游靶基因HO-1表达，HO-1发挥转录因子作用上调一些抗氧化基因[13]，上调Nrf2/HO-1可发挥抗氧化应激作用[14]。本研究结果显示，亚低温联合氯丙嗪组Nrf2和HO-1蛋白表达高于亚低温组和氯丙嗪组，说明亚低温联合氯丙嗪治疗上调Nrf2/HO-1通路，可能是其发挥抗氧化的作用机制。

综上所述，亚低温联合氯丙嗪可上调Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化作用，进而对脑缺血再灌注大鼠发挥神经保护作用。