蛋白质组学技术在牦牛乳研究中的应用

马静，孙璐

1(青海大学 畜牧兽医科学院，青海 西宁，810016) 2(青海高原牦牛研究中心，青海 西宁，810016)3(青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室，青海 西宁， 810016)

澳大利亚学者WILKINS等于1994年最早提出“蛋白质组(proteome)”的概念，蛋白质组学是阐明生物体基因组表达所有蛋白质的学科[1]。蛋白质组学技术补充了其他“组学”技术如基因组学和转录组学的不足，可阐明生物体蛋白质的身份以确定特定蛋白质的结构和功能，广泛应用于鉴定和定量细胞、组织或生物体中的蛋白质[2]。生物体的蛋白质含量随条件改变而变化，因此可采用蛋白质组学研究不同条件下蛋白质组成及变化规律的差异。考虑到生物系统的复杂性，一般采用高效液相色谱法对蛋白质混合物进行分离，用质谱来实现蛋白质组的鉴定分析[3]。蛋白质组分析最常用的是“自下而上”的方法，即将蛋白质水解成肽，用质谱对肽段进行鉴定、定性表征和相对定量分析，最后通过生物信息学手段明确蛋白的结构和功能[4]。与高效液相色谱相比目前同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for rand absolute quantification,iTRAQ)技术在蛋白组学应用较多，iTRAQ技术是由AB Sciex公司开发的等压标记技术，具有高通量，高稳定性且不受样品性质的限制的优点，可以同时标记8个样品的肽，并且可以获得有关其修饰及数量的信息[5]。iTRAQ已广泛应用于乳，微生物，动物，植物蛋白质翻译后修饰的研究。邓微等[6]为阐明牛初乳、牛常乳乳清蛋白的差异，利用iTRAQ 技术对两者进行蛋白质组差异分析，在得到的599 种具有定量信息的乳清蛋白中，鉴定出60 种差异蛋白。孙玉雪[7]为了加深山羊乳与牛乳中的蛋白质尤其是一些低丰度蛋白质的了解，应用基于iTRAQ同位素标记的定量蛋白质组学技术对山羊乳与牛乳乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白进行了定量表征。iTRAQ技术在乳中广泛应用明晰了多种哺乳动物的乳蛋白质谱，不仅为犊牛、羔羊早期断奶提供了潜在指导，也为初乳、常乳乳品质的改善以及婴幼儿奶粉和功能乳的开发提供了参考依据。

牦牛主要分布在喜马拉雅山脉和青藏高原地区，适应了高海拔和极端的气候条件，牦牛乳、肉是当地人主要的食物来源[8]。作为具有天然浓缩乳之称的牦牛乳，含有蛋白质、脂质、糖、免疫细胞和生物活性分子，可为机体提供营养，并具有抗炎和抗感染的功能。在安全性上，牦牛乳特有的蛋白质比普通牛乳蛋白的致敏性更低[9]。且牦牛乳中的总固形物(16.9%～17.9%)、蛋白质(4.9%～5.9%)和脂肪(5.5%～7.5%)的含量均高于普通牛乳，营养价值高，易消化吸收。此外，牦牛乳脂肪酸中的共轭亚油酸(conjugated linoleic acid, CLA)较普通牛乳含量更高[10]。目前，已有实验模型证明CLA有利于降低人体脂肪水平、血糖水平、动脉粥样硬化及癌症风险，CLA能调节免疫功能，有助于糖原的重新合成并增强骨骼矿化作用，补充CLA可增加脂肪分解作用并减少脂肪酸在脂肪组织上的积累[11]。乳作为婴儿营养的首选来源，其蛋白质和游离肽为婴儿生长提供部分必需氨基酸和非必需氨基酸，另外有充分的证据表明，随着婴儿生长发育的成熟，母乳有助于建立婴儿的先天性和适应性免疫反应[12-13]。蛋白组学技术的应用可以明晰乳中特征蛋白质与差异蛋白质，为婴幼儿配方乳粉细化和功能化配比研究提供理论依据。本文阐述了蛋白质组学技术在牦牛乳中的应用和牦牛乳蛋白质的组成，为牦牛乳功能成分的进一步研究提供理论基础。

1 蛋白质组学技术研究进展

1.1 样品保存

蛋白质组学技术可以同时鉴定和检测多个差异蛋白，是一门相对发展较快且较新的学科[14]。利用蛋白质组学技术对乳蛋白的组成进行分析之前，首先需要明确样品的保存方式，不同的保存方式会引起牛乳蛋白组表征结果的偏差[15]。一般牛乳的贮藏方式有两种，一种是加入防腐剂(如溴硝酚、重铬酸钾等)，分析前在4～8 ℃的振荡器上轻轻混合24 h。另一种是浸入液氮中快速冷冻，然后转移到-80 ℃的冰箱中保存[16]。一般使用基于溴硝酚的防腐剂在检测分析过程中会引起系统误差，对蛋白质结果测定影响最大，建议该情况下使用校正因子进行校正。

1.2 蛋白分离

1.2.1 高丰度蛋白质分离技术

乳中的高丰度蛋白质主要为酪蛋白(casein, CN)，主要分为α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)、κ-酪蛋白(κ-CN)[17]。LI等[18]为了比较不同品种水牛乳的蛋白质含量、组成和差异，通过反相高效液相色谱测定水牛乳的蛋白质组成。并通过二维凝胶电泳-质谱联用对不同品种水牛乳的蛋白质进行表征。二维凝胶电泳该技术将第一维的反相高效液相色谱与第二维的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)耦合，同时结合具有高分辨率功能与灵敏度和高质量精度的质谱，可更好地阐明复杂生物样品中蛋白质的同工型[19-20]。

1.2.2 低丰度蛋白质分离技术

低丰度蛋白在牛乳中所占比例较少，但具有重要的生物学功能。牛乳中低丰度蛋白质有乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白，乳铁蛋白，免疫球蛋白，糖蛋白，肽激素和酶等[21]。在低丰度蛋白分离过程中，高丰度蛋白会覆盖低丰度蛋白，并妨碍其检测的敏感性，需提前去除高丰度蛋白质，如何去高丰度蛋白十分重要。靳登鹏等[22]以1 月份左右的成熟乳为试验材料，先通过免疫亲和层析和ProteoMiner 低丰度蛋白富集试剂盒2种前处理方法去除高丰度蛋白，对母乳乳清蛋白组学进行了分析。免疫亲和层析(immunoaffinity chromatograph, IAFC)是以抗原或抗体中的一方作为配基亲和吸附另一方的分离方法。具有特异性目标蛋白的抗体与惰性微株共价结合，产生免疫吸附活性，然后将复杂的蛋白质混合物通过免疫吸附捕获目标蛋白质，而其他非目标蛋白质则在色谱柱中被冲走[23]。此外，离心也是获得低丰度蛋白质的主要途径。NISSEN等[24]在二维液相-二级质谱联用分析之前对乳样进行预分级分离，通过高速离心获得乳清，离心可有效提高低丰度蛋白的检测。

1.3 乳蛋白鉴定及定量

乳蛋白的鉴定及定量一般通过蛋白质组学分析完成，与酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)相比具有显着优势，蛋白质组学利用液相色谱和质谱来分离、鉴定和表征蛋白质，而不依赖抗体[25]。其中质谱分析是蛋白质研究的主要技术手段。质谱不仅可以测量多肽的分子质量，还可以确定氨基酸序列或连接位点和翻译后修饰的类型[26]。如今对鉴定、表征和定量蛋白质的灵敏度和准确性的要求越来越高，因此各种基于质谱的新型分析平台和实验方法显得尤为重要。

1.4 蛋白质组学生物信息学分析方法

蛋白质组学所包含的生物信息学分析内容有基因本体(gene ontology，GO)分析、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析、聚类分析、蛋白互作分析等。并结合特定的算法，根据蛋白质或蛋白质酶解物肽段的分子质量与蛋白质数据库进行比对，从而鉴定出样品中的蛋白质种类[27]。

2 牦牛乳蛋白质组成及特性

2.1 牦牛乳酪蛋白组成及特性

牛乳蛋白主要包括为酪蛋白、乳清蛋白(whey protein, LA)和脂肪球膜蛋白。其中80%是酪蛋白，包括αS1-CN，αS2-CN，β-CN和κ-CN 4种。酪蛋白是由位于6号染色体上的4个基因(CSN1S1，CSN1S2，CSN2和CSN3)编码并且编码区突变率较高[28]。牛乳中不同类型的酪蛋白因结构相似，能够自行结合形成聚集体，并与胶体磷酸钙形成胶束结构[29]，是实现酪蛋白功能的关键。CN是钙、磷和氨基酸的关键营养来源，满足哺乳动物新生婴儿的生长和能量需求[30]。牛乳中CN水解生成酪蛋白磷酸盐或肽类还可被广泛用于食品、制药行业[31]。CN衍生的许多肽具有不同的生理功能，被称为“生物活性肽”，这些肽可通过体内消化释放，也可通过酶促水解反应在体外释放[32]。β-CN衍生形成短链的蛋白质水解肽为阿片肽，与机体消化调节、营养物质的摄取、免疫调节和抵抗病原菌等有关[33]。κ-CN经胰蛋白酶水解后，生成Casopiastrin肽，它能够阻止纤维蛋白原与血小板结合，表现出抗血栓活性[34]。CN磷酸肽可以形成可溶性有机磷酸酯盐，充当不同矿物质(尤其是钙)的载体，具有细胞调节作用[35]。牦牛乳为CN性乳类，其含量较奶牛乳、骆驼乳、羊乳、水牛乳、驴乳、人乳相比最高，而且牦牛乳中κ-CN, αS2-CN, β-CN、β-乳球蛋白、钙和磷的含量显著高于荷斯坦牛乳，也是2种乳源酸化过程中表现出结构和性质差异的原因[36-37]。牦牛乳中CN具有良好的乳化性、溶解性和热稳定性，适用于食品添加剂广泛应用于食品工业中。但是，婴儿对CN的吸收率较低，牦牛乳CN与人乳相比含量过高不利于婴儿的消化吸收。在中国营养学会2019妇幼营养学术年会中来自荷兰瓦赫宁根大学乳品科学和技术学科教授、弗里斯兰坎皮纳大学首席科学家、维多利亚大学客座教授和国际乳品杂志主编THOM HUPPERTZ教授分享了有关CN矿化对婴幼儿消化吸收影响的新发现。当CN矿化水平较低时，其在胃内形成较小且松软的凝乳颗粒，而这些凝乳颗粒会比矿化水平高的CN形成的颗粒更容易被分解，而关于牦牛乳CN的矿化水平目前未见相关报道。

2.2 牦牛乳清蛋白组成及特性

LA是球形蛋白，被认为是一种快速的蛋白质，与CN相比，它可以快速到达空肠，水解速度较快[38]。LA包括β-乳球蛋白,α-乳白蛋白,免疫球蛋白,血清白蛋白以及乳铁蛋白和乳过氧化物酶等，占牛乳蛋白质的18%～20%[39]。乳清蛋白被认为是高品质的蛋白质，具有吸收率较高而脂肪、乳糖和糖类含量较低的生理特点同时含有丰富的支链氨基酸和生物活性多肽，具备了有益于人体的多种保健功能[40]。通常被用作膳食蛋白质的营养补充剂，可以参与免疫调节、改善肌肉强度和身体组成，并防止心血管疾病和骨质疏松症。乳清蛋白中含有的氨基酸和生物活性肽，在消化分解后会迅速吸收到循环系统中，有益于Ⅱ型糖尿病患者餐后血糖的改善。乳清蛋白直接刺激胰腺β细胞分泌，并通过肠降血糖素效应增加胰高血糖素样肽1和抑胃肽的分泌，使餐后血糖发生还原从而降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖浓度。当乳清蛋白酶促水解时所产生的衍生物由于营养上的氨基酸组成及低致敏性而被添加于儿童食品。含乳清蛋白的食物具有抗焦虑作用，可降低大鼠血压，预防腹泻等[41-43]。牦牛乳中乳清蛋白的比例与普通奶牛乳、山羊乳及水牛乳相似约为8∶2，牦牛乳清蛋白中致敏性β-乳球蛋白的含量是普通牛乳的1/5，以牦牛乳为婴幼儿奶粉，即避免了除致敏性蛋白的过程，还降低了牦牛乳营养成分的破坏，最大限度保留牦牛乳营养[44]。牦牛乳低致敏性和高消化率的特征更适合婴儿和特殊需求人群食用，是一种珍贵的乳品资源。

2.3 牦牛乳脂肪球膜蛋白组成及特性

乳脂肪球膜(milk fat globule membrane, MFGM)蛋白占乳蛋白的1%～4 %，是一个复杂的构建体，由蛋白质和脂质组成的3层膜，其内单层来源于乳腺细胞的内质网，外双层则来源于泌乳的乳腺的上皮细胞的顶膜，MFGM包括胆固醇，甘油磷脂，鞘脂和蛋白质[45]。其中以高浓度存在的蛋白质包括黏蛋白1、黄嘌呤氧化还原酶、酪氨酸、乳黏附素、CD 36、脂肪蛋白和脂肪酸结合蛋白[46]。乳脂肪球膜蛋白的结构和具有生物活性的成分不仅可以在婴儿生长和免疫调节过程中提供必需的营养物质，而且可以通过调节各种代谢来帮助婴儿肠道的结构和功能成熟。乳脂肪球膜蛋白周围的抗菌肽和表面碳水化合物可能对肠道微生物种群的建立至关重要，与机体早期免疫和抵抗炎症有关[47]。此外，LI等[48]通过GO富集和KEGG途径发现乳脂肪球膜蛋白与胞吞作用，生热作用，阿尔茨海默氏病，癌症和人乳头瘤病毒感染密切相关。乳脂肪球膜蛋白质在牦牛乳中与牛乳、山羊乳、水牛乳、骆驼乳相比所占比例最高[49]。LUO等[50]发现在牦牛乳脂肪球膜内存在不规则脂质结构域，而造成这一特殊脂质结构域的原因是高含量的鞘磷脂(sphingomyelin, SM)，高含量的SM有益于机体的新城代谢和消化系统健康，且牦牛乳的乳脂肪球比普通牛乳更大，在加工过程中更易于聚集，是制造黄油和酥油产品的理想来源[51]。牦牛乳作为独特的、高营养价值功能型保健食品，是机体生理机能调节及功能性食品开发的理想乳品资源。

3 蛋白质组学技术在牦牛乳研究中的应用

3.1 蛋白质组学在牦牛乳脂肪球膜中的应用

随着蛋白质组学技术在牦牛乳脂肪球膜中的广泛应用，其含量和结构也逐渐清晰地呈现在人们面前。为研究牦牛奶脂肪球膜的组成及其蛋白的热稳定性，何胜华等[52]用物理方法提取分离了牦牛乳中的乳脂肪球膜蛋白质并将洗涤前后的牦牛乳脂肪球膜进行SDS-PAGE分析，结果显示牦牛MFGM主要由蛋白质(26.93%)和脂类(70.34%)两大物质组成，还含有少量的己糖、唾液酸和灰分，其蛋白的主要氨基酸是谷氨酸、亮氨酸、丝氨酸和赖氨酸，其中必需氨基酸占整个氨基酸的49.48%；当温度升高至60 ℃ 的时候发现牦牛乳脂肪球膜蛋白发生变化属于热不稳定蛋白。JI等[53]通过相对定量和绝对定量蛋白质组学的方法在牦牛乳和普通牛乳之间共鉴定出450多种MFGM差异蛋白，通过比较差异蛋白相对丰度，发现糖基化依赖性细胞黏附分子1、CD59分子和乳黏附素等蛋白质在牦牛MFGM中的丰度要高得多(4.6～10.1倍)，比普通牛乳MFGM高得多。蛋白的生物学功能的GO富集分析结果表明，牦牛MFGM蛋白的主要分子功能与普通牛乳之间几乎没有差异。牦牛乳乳脂肪球膜蛋白为热不稳定蛋白，其结构与组成与普通牛乳存在差异，但两者主要的分子功能相似。目前人乳和普通牛乳的乳脂肪球膜蛋白组学被广泛研究，但牦牛乳脂肪膜蛋白潜在的生物活性与牦牛乳脂肪球膜各组成成分与其微结构之间的关系有待深入研究。

3.2 蛋白质组学技术在牦牛乳清蛋白中的应用

蛋白质组学技术在牦牛乳清蛋白中的应用大多都集中在对于牦牛乳清蛋白热变形机制和热凝聚作用的研究。王立枫等[54]在2017年通过使用体积排阻色谱法检测不同的加热温度和加热时间对牦牛乳清蛋白形态及质量分数变化的影响。结果表明，当加热温度高于β-乳球蛋白的变性温度会导致蛋白发生聚合，加热温度在牦牛乳清蛋白聚合中占据主导地位。YANG等[55]利用iTRAQ标记的蛋白质组学技术比较牦牛初乳和常乳中乳清的蛋白质谱。在牦牛乳清中鉴定出183种蛋白质；初乳和常乳乳清之间有86种蛋白的表达水平显著不同，其中血红蛋白的表达水平在初乳乳清中显著高于常乳乳清；许多差异表达的蛋白质与生物学调节和对刺激的反应有关。此外，一些研究阐述了牦牛乳清蛋白浓缩物的组成特点和功能性质。白莉莉[56]分析了牦牛乳清粉和牦牛乳清蛋白浓缩物的溶解性、持水性、持油性、起泡性、乳化性和热稳定性等功能性质并通过SDS-PAGE 鉴定了牦牛乳清粉和牦牛乳清蛋白浓缩物的乳清蛋白组成成分。对不同牦牛乳清蛋白的综合鉴定，可为婴幼儿奶粉的改良提供基础信息。

3.3 蛋白质组学技术在牦牛酪蛋白中的应用

由于牦牛乳酪蛋白胶束的凝乳特性及CN衍生肽的多种功能，现如今大多研究集中在通过蛋白质组学技术了解牦牛乳酪蛋白胶束及其生物活性肽。宋礼等[57]研究了胰蛋白酶制备牦牛乳酪蛋白降血压肽的最佳水解条件和分离纯化工艺，通过单因素、正交实验，确定了最佳水解条件并通过液相色谱及质谱检测，得到牦牛乳酪蛋白降血压肽的序列片段为HQGLPQEVLNENLLR、AVPYPQR和TKVIPYVR。王鹏杰[58]通过超速离心分离出牦牛乳酪蛋白胶束，用高效液相色谱测定胶束中蛋白的组成，发现牦牛乳酪蛋白胶束的理化性质与荷斯坦牛乳存在较大差异，对于己经成熟的荷斯坦牛乳的单元操作，不能直接地应用于牦牛乳。董爱军等[59]同样利用高效液相色谱准确分离定量了牦牛乳中的CN除α同乳白蛋白外，麦洼牦牛乳中αs-CN、β-CN、κ-CN、β-乳球蛋白、血清蛋白的含量均高于牛乳。因此牦牛乳具有很高的营养价值和开发利用价值。对与蛋白质组学技术在牦牛乳酪蛋白中应用，HPLC技术的使用广泛，而iTRAQ 技术的应用较为少见。iTRAQ 技术在牦牛酪蛋白中的使用可能更有利于婴儿配方乳中主要乳蛋白的精确表征和定量。

4 展望

随着蛋白质组学技术在牦牛乳中的广泛应用，使得鉴定和表征牦牛乳中主要蛋白质，蛋白质衍生物及最终产品更加准确高效。在公共安全领域，利用蛋白组学可以准确、快速、可靠地诊断食物过敏，尤其是牛奶过敏，由此避免严重的过敏反应。对于潜在的生物标志方面，乳蛋白组学成就也十分突出。蛋白质组学技术有助于阐释牦牛乳蛋白各个组分的功能，为充分利用牦牛乳资源,为婴幼儿提供理想营养奶粉提供基础。