食品中重金属的人体健康风险评估方法研究进展

李梦莹， 王成尘， 毕 珏， 覃一书， 王 坤， 向 萍

(西南林业大学生态与环境学院，云南 昆明650224)

重金属污染在全球范围内广泛蔓延，破坏环境且对人体健康造成严重危害.这一问题的根源通常被认为是城市化、土地利用变化和工业化的快速发展，特别是在人口众多的发展中国家[1-2].自工业革命以来，环境污染物的多样性呈指数增长且人为因素居首，因此，食品安全问题受到全球关注，特别是它们与人体健康不可分割的联系[3].有害的重金属(如As、Pb、Cd、Hg 等)通常被归类为人体的非必需元素，这些重金属对人体存在致癌、扰乱正常代谢活动等危害[4].一般来说，食品中的重金属总量与环境中的重金属浓度呈正比，然而食品中的重金属总量并不能完全反映实际进入人体的总量，因此迫切需要了解食品中重金属能够被人体吸收的部分(生物可给性)和实际进入人体的部分(生物有效性)，以便能更准确地进行评估[5-6].生物可给性是指重金属随食物摄入到胃肠道并从基质中释放到消化液的部分，它可能在消化过程中被肠道吸收[7].生物有效性是指重金属随食物被胃肠道吸收进入血液循环的部分，它可能通过血液循环并在特定的靶器官中发挥毒性作用[8].国内外研究人员对人体健康风险评估的方法从开始的风险评价公式发展到目前采用的肠道细胞模型[9-10].

本文综述目前常用的一些评估食品中的重金属在消化过程中危害人体健康的方法，基于这些方法的优势和局限性，提出未来的发展趋势，目的是说明建立更贴近人体真实数据的模型对人体健康风险评估具有实际意义.

1 采用人体健康风险评价公式和体外消化系统模型评价食品中重金属的生物可给性研究

1.1 人体健康风险评价公式

近十年来，环境污染物对食品质量的不良影响已威胁到其安全和人体健康，其中，重金属污染物可干扰人体代谢，引起相关疾病的发生甚至导致死亡[11-12].人体健康风险评价公式预测环境污染物可能对人体健康产生的有害影响，包括致癌风险评估、致畸风险评估和暴露评估等[13-14].该评价方法兴起于美国国家科学院和美国环保局，如今人体健康风险评估方法基本成型，已被许多国家和国际组织采用[15].我国健康风险评估方法还不健全，仍多借鉴国外方法，并对其进行总结和完善，从对单一污染物到多种污染物的评估，再从有害化学物质到非化学因子的评估[16-17].不同评价公式的侧重点不同，食品中的重金属对人体的毒害程度取决于摄入量，利用各种指标和参数进行评估，主要的评价公式如表1 所示[18-20].

表1 食物中重金属的人体健康风险评价公式Table 1 Formulas for human health risk assessment of food-derived heavy metals

采用人体健康风险评价公式进行食品中重金属的人体健康风险评估是最直接的方法，但也存在较大的不准确性.其中，公式中的参数是不确定的，参数的大小决定了风险程度.如研究人员运用目标危险系数进行评估，在暴露频率、暴露时间和平均体重等参数的不同选择，会导致目标危险系数可能在临界值1 上下浮动，大于1 则存在健康风险，小于1 则反之[21-22].大部分评价公式在应用的过程中没有根据区域的不同、饮食习惯的不同、不同人群的体重和食物摄入量等来考虑参数，选取参数的人为随机性较大.如果根据上述情况选择参数，则计算值更贴近实情.现有的评价公式均基于污染物总量，而非人体实际的吸收量，很难精准地进行评估.虽然能快速预测潜在风险，但其预设认为污染物进入人体后被100%吸收，这样可能会高估人体摄入量.摄入人体的污染物并不都是生物可利用的，只有被胃肠道吸收的部分才是生物可利用的.因此，应用评价公式要注重各参数的选择，使评估更加准确.

1.2 体外消化系统模型

人体胃肠道是一个复杂的生物反应器，它承担吸收营养供给生命活动的作用，并与血液循环、神经等系统有联系[23].食物经过口腔阶段的咀嚼后，通过食管到达胃部，在胃液消化的过程中，禁食状态下的pH从1.5 上升到2.0，进食状态下的pH 从3.0 上升到7.0[24].在胃阶段消化后的食物被运送到第一段小肠，即十二指肠，被胰腺分泌的胰酶及肝脏、胆囊分泌的胆汁分解，其pH 从2.0 上升到6.2，由此可见食物进入人体后会经过一系列复杂的消化过程[25].食物在上消化道(包括口腔、食道、胃、十二指肠)的消化率和位置会显著影响餐后代谢和人体健康[26].理想状态下，一个可靠和准确的食物消化研究应该在人体内进行，但其在技术和伦理上并不可行.因此，研究人员开发出体外消化系统模型，可以很好地模拟人体胃肠道.在过去的几十年间，体外消化系统模拟实验被广泛应用于研究食物在上消化道的变化及其对人体的影响，最初建立的目的是用来评估食品中营养元素的吸收量，后来又被应用到对重金属的评估上.采用体外消化系统模拟实验进行食品中重金属的人体健康风险评估，应以重金属的有效含量代替总量更具有实际应用价值，能更好地了解重金属在胃肠道消化过程中的含量，即生物可给性，与其他实验、公式评估等相比，该评估方法则更有效、更直接[27-28].

近年来，已经开发出从单个静态到动态的多种体外消化系统模型，且被广泛用于研究食物在体内的消化过程.大多数研究选用静态体外模拟方法，如生理原理提取法(PBET)、生物可给性研究(SBRC)、欧洲生物可给性标准法(UBM)和体外胃肠道法(IVG)等(图1a).不同方法在消化道组成上(口腔—胃—肠道、胃—肠道)，所用的消化液组分，使用的振荡频率、时间和pH 有所不同[29].最常用的消化液组分为胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、肽酶、α-淀粉酶、脂肪酶、胆盐和黏蛋白等.也有研究采用从人体中收集的胃液和十二指肠液，但大多数研究使用的消化液组分是从杂食动物(如猪、大鼠等)中收集或提取的[30-31].尽管采用的静态体外模拟方法存在差异，但消化温度均设定为37 ℃，样品在各类模拟消化液中的培养时间与人体中的消化时间相似.目前，研究人员采用不同的静态体外模拟方法测定食品中重金属的生物可给性，其模拟的胃肠液溶出重金属的比例为20%～95%，且胃相生物可利用率比肠相高，重金属生物可利用率的测定结果存在差异，说明静态体外模拟方法有一定的不准确性[32-33].研究结果存在的差异取决于选用的食物基质和体外消化系统模型，由于不同的模拟消化液成分和实验条件，以及提取过程中是否添加其他物质(如食品添加剂)，得到的重金属生物可给性结果存在一定的差异.所制备的食物样品颗粒大小也会影响实验结果，大颗粒样品通过胃的速度比小颗粒慢，需要较长时间消化，因此在设计含有较大颗粒食物的体外消化系统模型时，须考虑适宜的消化时间.模拟消化液中酶的浓度和组成也是设计体外消化系统模型时需要考虑的重要因素，通常较高的酶浓度会加速食物成分的消化或降解.尽管静态体外模拟方法被广泛应用于评估食品中重金属的生物可给性，但它们过于简单地模拟消化生理学，不能模拟消化过程的动态方面，只适合做基础的判定.

图1 体外消化系统模型示意图Fig.1 Schematic diagram of in vitro method

目前，研究人员已开发出更为复杂的动态体外消化系统模型，如人体肠道微生物生态系统(SHIME)、动态胃模型(DGM)、人体胃模拟器(HGS)、动态大鼠胃十二指肠系统(DRSD)和动态人体胃肠道系统(DHSI)等(图1b).在静态体外模拟方法上增加了食物的运输、消化液的连续分泌、可变的酶浓度和体内条件下随时间变化的pH 等[34].文献中第一个报道且应用较多的是人体肠道微生物生态系统模型，其装置简单，能模拟口腔、胃、小肠、升结肠、横结肠和降结肠6 个组织对食物的摄取与消化，一般用于药物和食品中各元素在胃肠道上的安全性评估等研究，但在模拟胃肠道蠕动等方面存在缺陷，没有考虑到代谢物的吸收机制，其可靠性程度仍有待商榷[35-36].近年来，研究人员借用3D 打印技术研制出人体胃模型，利用计算机控制使模型更贴近人体真实胃的状态.如动态人体胃肠道系统模型主要由硅胶材质的人体胃模型、机电仪器、辅助排空装置和温度控制系统组成，有研究显示在炖牛肉和橙汁的混合食物中，应用动态人体胃肠道系统模型模拟的胃排空曲线与人体的一致，模拟的数据更贴近人体真实数据[37-38].然而，动态人体胃肠道系统模型的最大缺点是难以找到合适的操作参数来预设胃排空曲线，加上食物与消化酶之间的混合不充分，模拟的食物消化率和消化程度通常低于人体真实数据.其原因是动态人体胃肠道系统模型缺少人体肠道上皮细胞的吸收过程，很难准确地模拟胃肠道的生理功能.图2 显示，食物中的重金属首先在胃肠液中溶解(过程A)，后被肠道细胞吸收(过程B)，最后经血液循环到各靶器官中(过程C).目前的体外胃肠道系统模拟法仅能模拟A 过程，无法模拟重金属跨过细胞膜和被肠道吸收的过程(B 过程)，因此仅仅依靠该方法模拟的结果往往不准确.尽管目前在体外消化模拟实验方面已取得了重大进展，但仍需进行大量工作，研制出统一的体外消化系统模型，使其评估数据与人体真实数据有极显著的关联，这样的模型才更可靠[39].

图2 食物中的重金属在人体胃肠道消化吸收的示意图Fig.2 Assimilation pattern of food-derived heavy metals in human intestine

2 采用动物模型和肠道细胞模型评价食品中重金属的生物有效性研究

2.1 动物模型

生物可给性和生物有效性评估目的相同，都是通过测定食物中所释放出的某种物质含量来进行人体健康风险评估，而生物有效性的评估结果更准确.研究人员最先使用动物模型进行评估[41]，如今大约有2 000万动物(如灵长类动物、猪、兔、老鼠等)被用于实验.猴子与人类的亲缘关系最近，但成本较高；猪的骨骼发育和物质代谢与人类极为相似，被认为是最理想的动物模型，然而猪的饲养成本过高，难以广泛应用；小鼠的物质代谢动力学与人类相近，且成本不高，易操作，更适用于实验[42-43].采用动物模型评估大多针对土壤中的重金属，尤其是矿区周边土壤中的重金属，目前动物模型已成为污染区周边人体健康风险评估的模型[44].随着研究的深入，动物模型被运用到对食品的评估上，在严格可控的暴露条件下评估多种类型的毒性作用(如急性毒性、亚急性毒性、慢性毒性等).鼠类和斑马鱼是使用最广泛的模型，通过生化分析等方法进一步确定各种毒性指标(如肝毒性、神经毒性、生殖毒性、免疫毒性等)[45-47].大部分食品中重金属的生物有效性研究采用灌胃或直接注射，还有一些研究将鱼(如斑马鱼、青鱂、新月鱼、红鲫等)作为模式动物，以确定食品中的重金属含量对人体健康的危害程度及其毒理机制[48].虽然动物模型实验是目前对人体健康风险评估最全面的方法，但动物成本高、实验周期长，很难对大批量样品进行分析，且伦理和物种间的差异也倍受质疑[49].为了能用体外消化系统模拟实验替代动物模型实验，研究人员将生物可给性实验与生物有效性实验结合起来，以检测体内与体外的实验结果之间是否存在相关性，这则需要更多的定量数据来验证体外消化系统模拟实验的准确性.只有当这两种方法之间存在一定的关系时，体外消化系统模拟实验才能替代动物模型实验.

2.2 肠道细胞模型

近年来，由于体外消化系统模拟实验和动物模型实验存在许多不足之处，研究人员建立了肠道细胞模型.人体对食物的吸收主要发生在小肠中，小肠是人体消化系统重要的组织，其肠道上皮细胞是极性细胞，肠腔侧分化出微绒毛以增大吸收面积，上皮细胞的紧密连接以保持上皮组织的完整性，上皮屏障组织下是黏膜淋巴组织，负责免疫系统的诱导和调节，保护其免受肠道病原体或有害物质的侵害(图3)[50].

图3 小肠细胞相互作用的示意图Fig.3 Schematic diagram of intestinal cell interaction

人体结肠癌细胞系被广泛应用于实验和机制研究，在市面上可买到的细胞系中，应用最广泛的是Caco-2 细胞[52].但Caco-2 单层细胞仅由吸收性肠道上皮细胞形成，无法模拟肠道上皮细胞与其他细胞复杂的相互作用和紧密连接蛋白的表达，而这对上皮组织完整性和极性的形成是很有必要的[53-54].Caco-2 细胞模型最初应用在医药领域，如今已被用于体外消化模拟实验，能模拟肠道细胞的转运过程，并提供与体内更相近的环境，该模型与体外消化系统模型相结合已成为食品科学和环境科学等领域新的应用模型[55-56].为解决物种间的差异问题，Fu et al[57]利用生理原理提取法结合Caco-2 细胞模型探究内蒙古铅锌矿周边小白菜和菠菜中Cd 和Pb 的生物有效性，结果表明，小白菜和菠菜中Cd 和Pb 的生物有效性(11.2%、9.4%)显著高于煮熟后(6.1%、3.2%)，因此不宜采用新鲜蔬菜中Cd 和Pb 的含量进行人体健康风险评估，且蔬菜中Cd 和Pb 的生物有效性也与Ca、Fe、醋等营养物质的摄入有关.方勇等[58]建立体外模拟消化/Caco-2 细胞模型来测定大米中Pb 的生物有效性，发现经胃肠道消化后籼米中Pb 的生物有效性均高于粳米，生米经胃肠道消化后，其生物有效性均高于蒸煮后的大米.Beri et al[59]将体外消化系统模型与Caco-2 细胞模型相结合进行评估，结果表明，种植在Cd 污染土壤中的甜玉米，其Cd 的生物有效性低，不会对人体健康造成不良的影响.Lei et al[60]为了筛选铁生物强化小麦品种，采用体外模拟消化/Caco-2 细胞模型评估我国10 种小麦面粉中Fe 的生物有效性.Flores et al[61]在研究缺铁症方面，对比亚洲人常食用的13 种海藻和菠菜中Fe 的生物有效性，结果表明，除紫菜和海白菜较高外，大部分海藻同菠菜一样，其Fe 的生物有效性低，表明某些海藻可能是膳食Fe 摄入的良好食物，但几个海藻中的As 含量很高，这也可能限制了它们作为Fe 的来源食物.Rodriguez-Ramiro et al[62]采用体外模拟消化/Caco-2 细胞模型，比较了3种商业面包制作工艺(酸面团、传统酵母、乔利伍德面包)对Fe 生物有效性的影响，发现采用酸面团加工工艺，可提高面包中Fe 的生物有效性.这些研究从侧面反映出建立的体外模拟消化/Caco-2 细胞模型，是测定食品中重金属生物有效性的一种有效方法，可为研究重金属的毒性提供一种新的思路和手段.物质的吸收一般在小肠中进行，小肠包含了肠道上皮细胞、内分泌细胞、外分泌细胞和M 细胞等，其中，肠道上皮细胞数量最多，承担80%～90%的吸收功能，肠道上皮组织的紧密性和亲脂性构成物质吸收的天然屏障[63-64].然而体外模拟消化/Caco-2 细胞模型缺乏表达小肠上皮组织的某些特定物质和转运体，与上皮细胞的紧密性也存在一定差异，且各实验室生物因素和研究条件的不同也有可能导致实验结果的不准确性[65-66].

为了完善Caco-2 细胞模型，研究人员开发了Caco-2 细胞与其他类似人体肠道细胞共培养模型[67].其中，亚克隆细胞HT29-MTX 与Caco-2 细胞的共培养模型被认为是比Caco-2 单层细胞模型更好的生物有效性实验模型[68].HT29 细胞株生长在具有不连续的根尖刷状边界的极化单层中，微绒毛比Caco-2 细胞小，但细胞的大小和复杂性相似，它不仅可以为肠道菌群提供营养，还可以产生起屏障作用的抗菌肽和免疫球蛋白A，表明含有黏液层的细胞模型有很好的生理适应性[69-71].Stuknyte et al[72]应用体外胃肠道模拟消化模型和Caco-2/HT29 共培养细胞模型测定市场上出售的面包所释放的谷蛋白外啡肽，结果表明，外啡肽A5 和C5 存在人体肠道黏膜转运的可能性.体外胃肠道消化模型与Caco-2/HT29 共培养细胞模型联用，可比Caco-2 单层细胞模型更好地模拟食物消化吸收的全过程.有研究发现，当用纳米银处理Caco-2/HT29 共培养细胞模型时，黏液层的存在导致纳米银对细胞活性氧和白细胞介素-8 产生影响，且Caco-2 单层细胞模型缺少了人体小肠上皮组织中存在的M 细胞，而M 细胞负责抗原的识别与传递功能，它们不仅在物质吸收的过程中发挥作用，同时也起着重要的免疫作用，如通过细胞识别吞噬并呈递细菌、病毒、纳米颗粒和微粒等[73-74].有研究发现，Raji B 淋巴细胞可弥补这一缺点，使部分Caco-2 细胞在Raji B 细胞的作用下分化为类似的M 细胞表型，Araujo et al[75]证明了3 种类型细胞共培养时具有人体肠道上皮细胞的特征.Raji B细胞的引入使得Caco-2/HT29-MTX 模型(图4)的功能进一步增强，体系更接近人体肠道的真实环境，但该模型目前还较少应用于食品研究中，大多数用于药物研究，今后应利用该模型以更好地评估食品中的重金属对人体健康的危害.

图4 构建的体外人体肠道细胞模型示意图Fig.4 In vitro human intestinal cellmodel constructed by Transwell device

3 结论与展望

在过去的几十年间，食品中重金属的人体健康风险评估方法越来越完善，从评价公式到体外消化系统模型再到肠道细胞模型得到越来越广泛的应用.以下是目前各方法的总结，并对未来更先进的风险评估技术的发展提出几点建议:

(1)评价公式是所有方法中最直接、简单和快速的方法，可以通过计算来判定食品中的重金属对人体健康是否存在危害，参数一般以食品中重金属的总含量为准，但只有被人体胃肠道吸收的部分才是生物可利用的，评价公式在后期的应用上要更注重各参数的选择，如年龄、性别、人群类型、疾病状态等因素，这些因素都可能影响其评价的准确性.

(2)动物模型实验是健康风险评估最系统的方法，不仅可以评估食品中的重金属在胃肠道的含量，而且能更清楚地了解重金属对其他身体组织的危害.但模式动物在新陈代谢、生理学和遗传学上的物种间差异会大大影响研究结果的可靠性，动物模型不能完全表达人体的真实状况.

(3)体外消化系统模拟实验相对于动物模型实验具有更快、更好的重现性，更低的成本以及没有伦理限制的优点，近年来越来越广泛用于食品研究，但大多数体外消化系统模型没有完全模拟人体胃肠道的形态和解剖学特征.为了使体外消化系统模型更加逼真，应考虑更多的解剖学细节，如绒毛、胃肠道的皱纹和尺寸以及相关的蠕动和生化条件等.当前体外消化系统模型均未针对人体真实数据进行充分验证，且未得到广泛应用，今后的研究应将体外消化系统模型与肠道细胞模型结合起来.

(4)肠道细胞模型是目前研究方法中模拟人体胃肠道最真实的模型，可以消除动物模型与人体的巨大差异是它最大的优点.现阶段肠道细胞模型还无法模拟出肠道中的微生物等成分，这会对人体真实数据的模拟准确度造成影响.食品中的重金属元素众多，而元素之间的相互作用对人体吸收机制的影响并没有完全明了，希望肠道细胞模型能帮助研究人员对此有更深入的了解.