基于核酸适配体调控噻菁染料聚集体构建铅离子检测方法

赵 晗 于丽佳 吴志生 张颖琳 张华伟 师晓栋

(1.国家卫生健康委职业安全卫生研究中心，北京 102308；2.泰州医药高新技术产业开发区管理委员会，江苏 泰州 225300)

铅(Pb)在自然环境中稳定性强且不易降解，长期接触会在人体内累积[1]，对中枢神经系统[2-4]、肾脏[5]、生殖系统[6]、骨骼[7]等造成损害。因此，开发一种快速、高效且特异性强的铅离子检测方法对人体健康和环境保护具有重要意义。

目前，关于重金属检测比较成熟的方法主要有原子吸收法[8]、原子荧光法[9]、电感耦合等离子体质谱法[10]、双硫腙比色法[11]等，这些方法具有准确度高、选择性好、抗干扰能力强等优点，但存在前处理复杂、需要大型仪器支持、检测速度慢等缺点。近年来，一些依赖于纳米材料或核酸适配体的新型检测技术也常被用于重金属检测，主要包括电化学分析法[12]、荧光法[13]、化学发光法[14]、比色分析法[15]等。核酸适配体是一段具有三维空间结构的单链DNA或RNA，其可以与靶标发生特异性结合[16]。因此，构建检测方法时，适配体可被用作一种优良的分子识别元件。由于适配体是在体外设计和筛选的，原则上任何靶标都可以有其对应的适配体，且适配体在信号传导和化学修饰方面具有更加优良的特性，因此应用适配体技术的检测方法往往具有更高的灵敏度。

近年来，菁染料以其良好的物理化学性质在生物检测领域受到广泛的关注[17-18]。菁染料是一类非常重要的有机功能染料，具有摩尔吸收系数高、光谱范围广、荧光量子产率高等优点[19]。相比于传统单分子探针，菁染料超分子聚集体的优越性主要体现在：① 菁染料在溶液体系中可以自组装形成高级聚集体；② 菁染料的聚集体对环境敏感，超分子聚集体可以被调控，自身的浓度、结构、体系中所带的电荷和环境温度可以调控菁染料聚集体；③ 菁染料的聚集体识别信号可以级联放大[20]。研究拟利用Pb2+适配体和噻菁染料结合生成特异识别模块，使其与Pb2+发生高特异性结合形成G-四链体结构，此G-四链体可将体系中以二聚体形式存在的噻菁染料(Dye2)诱导解聚为单体，比较其吸光度差异，以实现对Pb2+简便、快速、高效的检测，旨在构建一种快速高效检测水中Pb2+的方法。

1 试验部分

1.1 试剂与仪器

铅离子适配体：序列为T30695(5’-GGGTGGGTGGGTGGGT-3’)，生工生物工程(上海)股份有限公司；

MgCl2·6H2O、ZnCl2、NiCl2·6H2O、CoCl2·6H2O、CrCl3·6H2O、NaCl：分析纯，北京化工集团有限公司；

Pb2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+标准溶液：1 000 μg/mL，中国计量学院；

2-甲基苯并[1,2-d]噻唑：萨恩化学技术(上海)有限公司；

2-(甲硫基)苯并噻唑、1，3-丙磺酸内酯：梯希爱(上海)化成工业发展有限公司；

集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101K型，郑州恒岩仪器有限公司；

旋转蒸发器：RE-201D型，巩义市河洛德正仪器厂；

紫外可见分光光度计：UV 3600 Plus型，日本岛津公司；

手提式紫外分析仪：WFH-2048型，杭州齐威仪器有限公司。

1.2 重金属Pb2+检测原理

T30695[21]作为Pb2+适配体，可以在Pb2+存在的情况下形成G-四链体。试验研究在Pb2+存在下通过寡核苷酸序列T30695对噻菁染料的二聚体和单体进行组装和拆卸的物理过程。该噻菁染料(Dye2)在甲醇中主要以单体形式存在，在水溶液中主要以二聚体形式存在，以T30695为模板可将Dye2的二聚体诱导成单体。基于噻菁染料在二聚体和单体之间的组装转化特性，通过Uv-vis光谱变化在T30695的存在下构建一种简单的Pb2+检测方法(见图1)。在体系中缺乏Pb2+的情况下，Dye2的二聚体不能被T30695解聚；加入Pb2+后，二聚体可被诱导成单体与G-四链体相互作用。

矩形代表Dye2单体，菱形代表G-四分体图1 重金属Pb2+检测机制示意图Figure 1 Schematic diagram of heavy metal Pb2+ detection mechanism

1.3 试验方法

1.3.2 Dye2在溶液中的聚集状态 将3.5 μL 500 μmol/L 的Dye2储备液分别加入到346.5 μL不同比例的甲醇—超纯水混合液中(V甲醇∶V超纯水分别为0∶10，1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1，10∶0)，室温下避光反应2 h，测定紫外吸收光谱。

1.3.3 体系中适配体T30695浓度优化 将3.5 μL 500 μmol/L 的Dye2储备液分别加入到不同体积的超纯水中，再加入不同体积的100 μmol/L的T30695和21 μL 500 μmol/L的铅离子溶液，室温下避光反应2 h，测定紫外吸收光谱。

1.3.4 体系反应时间优化 向超纯水中加入500 μmol/L 的Dye2储备液3.5 μL和100 μmol/L适配体T30695 26.25 μL，再加入500 μmol/L铅离子溶液21 μL，涡旋后立即检测紫外吸收光谱，并每隔2 min检测一次，直至混合液的紫外吸收光谱无变化。

1.3.5 铅离子紫外光谱检测 将Dye2溶解于甲醇中，制成500 μmol/L的储备液。先向EP管中加入不同体积的超纯水，再加入500 μmol/L的Dye2储备液3.5 μL，涡旋并避光保存10 min。然后加入100 μmol/L的核酸适配体T30695 26.25 μL和不同体积的铅离子溶液500 μmol/L，涡旋，最终混合液总体积为350 μL。将混合液于室温下避光反应2 h，同时配制空白样品作为比对。将混合液转移至比色皿中，检测300～600 nm的紫外吸收光谱。

1.3.6 离子特异性 向每个EP管中依次加入超纯水，500 μmol/L 的Dye2储备液3.5 μL和100 μmol/L适配体T30695 26.25 μL ，分别向每个EP管中加入不同的金属离子溶液(Mg2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Cr3+、Na+、Pb2+、Fe3+、Hg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+)，最终混合液总体积为350 μL。溶液充分振荡，避光反应2 h，测定紫外吸收光谱。

1.3.7 回收率试验 向每个EP管中加入稀释1 000倍后的自来水(稀释是为了减少自来水中其他离子对试验的干扰)、500 μmol/L的Dye2储备液3.5 μL和100 μmol/L 适配体T30695 26.25 μL，再加入不同浓度的铅离子储备液，涡旋，最终混合液总体积为350 μL。将混合液于室温下避光反应0.5 h，检测300～600 nm的紫外吸收光谱。

1.3.8 数据处理 采用Origin 8.5软件对试验数据进行处理分析。

2 结果与讨论

2.1 噻菁染料Dye2的聚集状态

由图2可知，超纯水中，Dye2在422 nm处有主要吸收峰，445 nm处有一个小肩峰，与文献[23-25]报道相似。422 nm 处的吸收峰为二聚体峰，445 nm处为单体峰，二聚体的形成主要归因于染料与水分子之间的氢键作用形成面对面的堆积模式。

由图3可知，随着溶剂中甲醇比例的增加，Dye2紫外吸收峰由422 nm(二聚体)向445 nm(单体)转化，即二聚体转变为单体；当V(甲醇)∶V(超纯水)≥7∶3时，A422 nm/A445 nm几乎不变，表明此时体系中反应已达平衡。

Chibisov等[26]研究发现，Dye2的类似物即芳环上修饰甲氧基和氯原子的化合物，单体和二聚体之间的转化受体系温度的影响。由图4可知，当体系温度为4～70 ℃ 时，二聚体与单体的吸光度比值不变，说明低于70 ℃ 时，Dye2聚集体受外界温度影响不大，因此试验选择室温条件下进行。

图2 Dye2在不同比例的甲醇和超纯水中的聚集状态Figure 2 Aggregation state of Dye2 in different VMeOH/VH2O

图3 不同比例的甲醇和超纯水对Dye2聚集状态的影响Figure 3 Effects of different VMeOH/VH2O on the aggregation state of Dye2

图4 温度对Dye2聚集状态的影响Figure 4 Effects of different temperature on the aggregation state of Dye2

2.2 T30695浓度优化

T30695作为Pb2+的核酸适配体，在铅离子存在条件下能形成G-四链体，该过程涉及到序列由单链转化DNA二级结构G-四链体，核酸空间结构的转化可能会影响聚集体的空间构型。由图5可知，随着T30695浓度的增加，Dye2在422 nm处吸收峰(二聚体)逐渐降低，445 nm处吸收峰(单体)逐渐升高。由图6可知，A422 nm/A445 nm随铅离子浓度的增加逐渐降低，说明体系中T30695的浓度会影响Dye2的聚集状态。当T30695浓度增加至3 μmol/L 时，A422 nm值达到峰值，体系主要以二聚体形式存在，当T30695浓度增加至15 μmol/L时，A422 nm/A445 nm不再改变，体系主要以单体形式存在，说明此时体系达到平衡。

2.3 体系反应平衡时间

固定铅离子的浓度，考察不同时间点Dye2聚集体转化情况。先检测未加Pb2+的情况，再加入Pb2+后立即进行检测，此后每2 min检测一次。由图7可知，当加入Pb2+6 min后，样品的Uv-vis光谱再无变化，此时的A422 nm/A445 nm变化幅度较小(见图8)，反应接近平衡，表明此方法需6 min即可检测样品中的Pb2+，因此，铅离子最佳的反应时间为6 min。

图5 T30695浓度对Dye2紫外吸收的影响Figure 5 Effects of different concentrations of T30695 on absorption spectra of Dye2

2.4 线性范围与检测限

在最佳试验条件下，向体系中加入不同浓度的Pb2+标准溶液，考察Dye2聚集体转化与铅离子浓度的关系(图9)。由图9、10可知，最佳试验条件下，当Pb2+浓度为0.25～10.00 μmol/L时，A422 nm/A445 nm与铅离子浓度呈良好的线性关系，校正曲线方程为y=1.497-0.046x，检出限为0.115 μmol/L。

图7 不同反应平衡时间的Uv-vis光谱Figure 7 The Uv-vis spectra of the reaction equilibrium time

图8 反应平衡时间对A422 nm/A445 nm的影响Figure 8 Effect of reaction equilibricum time on A422 nm/A445 nm

图9 Pb2+浓度对聚集体的影响Figure 9 Effect of increasing Pb2+ concentration on aggregates

图10 A422 nm/A445 nm与Pb2+浓度的关系Figure 10 The illustration is the relationship between A422 nm/A445 nm and Pb2+ concentration

2.5 特异性

为了验证此方法的特异性，一共选择了11种金属离子(Pb2+，Na+，Cu2+，Cd2+，Mn2+，Cr3+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Hg2+和Fe3+母液浓度为500 μmol/L，工作液浓度为7.5 μmol/L)在最优条件下进行试验(图10)。将每种离子测得的A422 nm/A445 nm比值作对比(图11)，与其他金属离子相比，加入铅离子的A422 nm/A445 nm显著下降，且差异最大，表明此方法具有良好的Pb2+特异性。虽然T30695序列中含有碱基T，但是Hg2+离子没有产生较大干扰，可能是没有形成T-Hg-T的双链构型[27]。研究[28]表明，K+可诱导T30695形成G-四链体，尤其是低浓度下也可形成G-四链体。试验发现K+的干扰显著降低。

图11 体系中加入不同金属离子的Uv-vis光谱Figure 11 The Uv-vis spectra of different metal ions added to the system

图12 Dye2/T30695体系对Pb2+的特异性影响Figure 12 The specificity of Dye2/T30695 system for Pb2+

2.6 回收率试验

为了测试噻菁染料Dye2的潜在应用能力，用该方法进行了回收率试验，结果见表1。由表1可知，当加标量为2，4，5，7 μmol/L时，实际测试的样品浓度与加入量的浓度差值较小，回收率为93.5%～101.4%，RSD<7%，具有较好的准确度和回收率，表明所建立的方法可用于自来水中铅离子检测。

3 结论

研究建立了一种基于噻菁染料Dye2-适配体T30695快速、高灵敏度、高特异性检测重金属铅离子的方法，此方法的检出限为0.115 μmol/L，加入铅离子后仅用6 min即可使反应达到平衡，从而实现快速高效的检测水中铅离子。由于自来水中含有一定的钾离子且适配体对其响应，因此需对自来水进行倍比稀释以降低背景干扰。试验所建立的方法在实际样品检测过程中可满足高浓度铅离子(>23.8 mg/L)的检测需求，后续可通过构建双链体系来降低钾离子的干扰，同时提高其检测限。

表1 自来水中的Pb2+回收率Table 1 The recovery results of Dye2 with addition of different concentrations of Pb2+ in tap water (n=3)