赖氨酸—木糖体系美拉德反应产物的优化制备及抑菌性

2021-01-25 05:23孙炜炜段丽萍
食品与机械 2021年1期
关键词:褐变木糖赖氨酸

孙炜炜 蔡 超 段丽萍 陈 胜 陈 浩 金 皓 朱 杰

(1.武汉黄鹤楼香精香料有限公司,湖北 武汉 430050;2.武汉黄鹤楼新材料科技开发有限公司,湖北 武汉 430050)

为了防止食物变质,化学合成类防腐剂成为食品中必须添加的成分,但其若在人体内长期积累,则会具有一定的负面影响[1]。目前天然防腐剂主要来自于植物、动物和微生物产生的活性抑菌成分。如,植物源的黄酮类化合物用于水产品的保质、动物源的壳聚糖用于醋腌食品的防腐等[2]。但天然抗菌物质提取、分离纯化步骤复杂,技术要求较高等制约了其大规模的商业化应用[3]。

目前,美拉德反应产物(Maillard reaction products,MRPs)已被证实存在良好的抗菌性能[4]。美拉德反应是指氨基酸/蛋白质和还原糖之间发生的一种非酶褐变反应,又称羰氨反应。大多数食品中都含有羰基(源自糖或油脂氧化酸败等)和氨基(源自氨基酸、肽和蛋白质等),因此这类反应普遍存在于食品加工和贮存过程中。MRPs主要包括香味物质、紫外吸收中间体和深棕色高分子化合物类黑素等,其赋予了食物诱人的色泽、浓郁的芳香和醇厚的滋味。但反应控制不当时,可产生一些危害衍生物如丙烯酰胺、杂环胺类、晚期糖基化末端终产物(AGEs,如羧甲基赖氨酸、戊糖苷素、3-脱氧葡萄糖酮酸、吡咯素、吡咯醛、丙酮醛等) 等物质,可引起癌症及慢性疾病的发生[5](人体动脉粥样硬化、视网膜病变、神经衰退性疾病及糖尿病等)。已有研究[6-7]表明上述危害衍生物的形成都会受到抗氧化剂成分的抑制作用,主要包括自由基清除、羰基捕获和金属离子螯合3种机制。此外,赖氨酸—木糖体系美拉德反应产物(XL-MRPs)存在较强的抗氧化活性[8]。试验拟以木糖(Xylose)和赖氨酸(Lys)为原料,以抗氧化活性及褐变程度为评价指标,通过分别控制不同变量(反应时间、反应温度、反应pH和n木糖∶n赖氨酸)进行单因素试验,再以FRAP为响应值进行试验条件设计,优化木糖—赖氨酸体系美拉德反应的制备条件,旨在加深对XL-MRPs宏观特性的理解,并为天然防腐剂的开发应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

木糖(Xylose):上海山浦化工有限公司;

赖氨酸(Lys):天津市光复精细化工研究所;

无水醋酸钠、冰乙酸、盐酸、硫酸亚铁、硫酸、碳酸氢钠、TPTZ、氯化钠等:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;

试验用RO水。

1.2 仪器与设备

可见分光光度计:722型,天津冠泽科技有限公司;

分析天平:BS-210型,德国Sartorius Instruments公司;

立式压力蒸汽灭菌锅:BXM-30R型,上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 试验方法

1.3.1 单因素试验

(1) 反应时间对XL-MRPs抗氧化活性及褐变程度的影响:将Xylose和Lys按n木糖∶n赖氨酸=1∶1称取,加入蒸馏水并定容至100 mL,调节pH至7.0,120 ℃下分别反应0,30,60,90,120,150 min,反应产物于4 ℃冰箱中备用,考察反应时间对褐变程度和XL-MRPs抗氧化活性的影响。

(2) 反应温度对XL-MRPs抗氧化活性及褐变程度的影响:将Xylose和Lys按n木糖∶n赖氨酸=1∶1称取,加入蒸馏水并定容至100 mL,调节pH至7.0,分别于80,90,100,110,120,130 ℃下反应120 min,考察反应温度对褐变程度和XL-MRPs抗氧化活性的影响。

(3) 反应pH对XL-MRPs抗氧化活性及褐变程度的影响:将Xylose和Lys按n木糖∶n赖氨酸=1∶1称取,加入蒸馏水并定容至100 mL,分别调节pH为5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,110 ℃反应120 min,考察pH对褐变程度和XL-MRPs抗氧化活性的影响。

(4)n木糖∶n赖氨酸对XL-MRPs抗氧化活性及褐变程度的影响:将Xylose和Lys分别按n木糖∶n赖氨酸=1.0∶1.0,1.5∶1.0,2.0∶1.0,1.0∶1.5,1.0∶2.0称取,加入蒸馏水并定容至100 mL,调节pH至9.0,110 ℃反应120 min,考察n木糖∶n赖氨酸对褐变程度和XL-MRPs抗氧化活性的影响。

1.3.2 响应面试验设计 根据响应面法中Box-Behnken设计(BBD)原理,以反应时间、反应温度、反应pH、n木糖∶n赖氨酸为试验因素,以FRAP为响应值,设计四因素三水平响应面试验优化XL-MRPs的制备条件[9]。

1.3.3 XL-MRPs的抑菌性 采用抑菌圈法测定XL-MRPs对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用[10]。

1.3.4 XL-MRPs的抗氧化性能 以FRAP值作为抗氧化性能的考察指标,参照文献[11]的方法进行测定。

1.3.5 XL-MRPs的褐变程度 采用吸光度法[12]。

1.3.6 数据处理 所有试验平行3次,结果取平均值。运用Origin 2018、Design Expert 8.0.6软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1可知,当反应时间≤120 min时,XL-MRPs的抗氧化活性及褐变程度均随反应时间的延长而增大,其中FRAP值由0.23增大至0.73,抗氧化能力提升3倍以上,且反应体系前30 min产生褐变物质的速率最快(斜率最大);当反应时间>120 min时,随着反应时间的延长,XL-MRPs的抗氧化活性及褐变程度缓慢减小,说明MRPs中具有抗氧化活性的成分以及褐变物质易于在反应进行的前期阶段形成,反应过程中,中间产物经脱氢、缩合、分子重排生成的类黑精和挥发性杂环化合物增多,XL-MRPs的抗氧化活性增强,褐变程度加深;反应后期,这些具有抗氧化活性的物质会继续反应而损失减少,可能是由于高温反应时间过长,生成的物质降解导致的[13]。故控制体系反应时间为120 min左右能产生最大的抗氧化能力和褐变程度。当反应温度由90 ℃升高至110 ℃时,体系褐变程度加深,抗氧化活性增强;当反应温度继续升高至130 ℃时,XL-MRPs的褐变值由0.484降至0.308,FRAP值由0.69降至0.32。一般而言,高温有利于美拉德反应的进行,使得反应体系在较短时间内生成较多的还原酮杂合物和类黑精等化合物,这些物质对MRPs的还原力有重要贡献,XL-MRPs的抗氧化活性增强;温度过高会使生成的中间产物发生分解,导致抗氧化活性降低[14]。因此控制体系反应温度为109 ℃,此时有最大的抗氧化能力和褐变程度。当反应体系初始pH从5.0上升至9.0时,FRAP值及褐变吸光度均逐渐增大,体系抗氧化活性和褐变程度逐步增强,可能是由于参与美拉德反应的是胺离子,反应体系碱性越强,尤其是当pH>7.0时,胺离子的质子被释放,增加了参与美拉德反应的游离氨基的有效浓度,体系pH增加有利于XL-MRPs的形成,生成的类黑素等化合物含量较高,抗氧化活性增强。因此体系pH为9.0时,褐变程度和抗氧化活性均最大。当增加反应体系中木糖含量时,XL-MRPs的FRAP值及褐变程度均明显提高;其中,当n木糖∶n赖氨酸为2∶1时,XL-MRPs的FRAP值最高,表现出较强的抗氧化活性,此时体系也有最大的褐变程度。综上,赖氨酸—木糖体系美拉德反应最佳制备条件为:反应时间120 min,pH 9.0,反应温度110 ℃,n木糖∶n赖氨酸为2∶1。此外,褐变值和FRAP值总是同时达到最大,且同步增大和减小,表明体系美拉德反应进程中抗氧化产物和形成褐变的物质总是同步产生或损失。

图1 各因素对XL-MRPs褐变程度和抗氧化活性的影响Figure 1 Effects of different conditions on the browning degree and antioxidant activity of XL-MRPs

2.2 响应面试验

在单因素试验基础上,采用Box-Behnken中心组合原理对XL-MRPs制备条件进行优化,试验因素和水平见表1,试验设计与结果见表2。

利用Design-Expert 11.1.0.1软件对响应面试验结果进行回归分析,得到XL-MRPs的FRAP值与各因素的回归方程:

Y=1.29+7.285E-003A+0.092B+0.042C+0.13D+0.013AB+0.025AC-0.051AD+0.070BC+0.013BD-0.070CD-0.094A2-0.093B2-0.14C2-0.11D2。

(1)

经响应面分析得XL-MRPs的最佳制备条件为反应时间119.87 min,反应pH 8.97,反应温度109.49 ℃,n木糖∶n赖氨酸=2.1∶1.0,此条件下XL-MRPs的预测FRAP值为1.32。由于实际操作等因素影响,将最佳制备条件修正为反应时间120 min,反应pH 9.0,反应温度109 ℃,n木糖∶n赖氨酸=2.1∶1.0,进行验证实验(n=3),得实测FRAP值为(1.33±0.16),与预测值相符,证明用所建模型预测XL-MRPs的FRAP值是准确可行的。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 Experiment design of response surface factor

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experiment design and results of response surface methodology

2.3 XL-MRPs的抑菌性

由表4可知,XL-MRPs对3种供试菌均具有抑菌圈,同浓度下其对大肠杆菌的抑菌圈最大,金黄色葡萄球菌的次之,枯草芽孢杆菌的最小。3种供试菌中,金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,大肠杆菌为革兰氏阴性菌,说明XL-MRPs对革兰氏阳性菌及阴性菌均有抑菌作用,且对革兰氏阴性菌的抑制作用强于阳性。随着XL-MRPs稀释梯度的增加,其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制能力逐渐增强。当XL-MRPs稀释至10-6梯度时,产生的抑菌圈直径均小于抑菌性判断标准的(7 mm),说明在此梯度下XL-MRPs没有抑菌性,故最小抑菌浓度为10-6。

表3 回归模型方差分析†Table 3 Regression coefficient and variance analysis

3 结论

以赖氨酸和木糖作为原料制备美拉德反应产物,其最优制备条件为反应温度109 ℃,反应时间120 min,反应pH 9.0,木糖与赖氨酸摩尔比2.1∶1.0。此条件下木糖—赖氨酸体系美拉德反应产物的抗氧化性最强,FRAP值为1.33±0.16。木糖—赖氨酸体系美拉德反应产物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌均具有抑菌作用,且木糖—赖氨酸体系美拉德反应产物溶液的最小抑菌浓度为10-6。后续拟开展中试论证试验,设计赖氨酸—木糖美拉德反应产物的规模化生产工艺路线。

表4 XL-MRPs稀释梯度对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑菌圈直径的影响†Table 4 Effects of different concentration of XL-MRPs on the diameter of inhibition zone of Escherichia coli,Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis mm

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