GREM1在人胆管癌中的表达及临床意义*

吕秀芳，周晓倩

（1南通大学医学院病理学系，江苏 226001；2贵阳市第一人民医院消化内科）

胆管癌（cholangiocarcinoma，CCA）是起源于胆管上皮细胞、具有高度侵袭性的恶性肿瘤。胆管癌好发于东南亚地区，以我国和泰国为主，西方国家胆管癌发病率也呈逐年上升的趋势[1-2]。在众多发病危险因素中，多种原因引起的慢性胆道阻塞是主要诱因之一[3]。胆道阻塞导致胆汁淤积，肝内胆汁酸和其他有毒化合物累积，触发细胞和分子复杂的级联反应，引起组织纤维化，最终形成终末阶段肝硬化，导致器官衰竭或肿瘤发生[4-5]。GREM1基因最早于1998年在非洲爪蟾中发现[6]，其编码的分泌型糖基化蛋白可以与骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）结合，发挥拮抗剂作用。GREM1参与肝纤维化[7-8]、肾纤维化[9-10]和肺纤维化[11]等病理过程。本文研究GREM1在胆管结扎诱导的大鼠肝纤维化组织、人胆管癌组织中的表达，并探讨其在胆汁淤积性肝纤维化和胆管癌中的表达意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 抗GREM1抗体（Sigma，美国），免疫组化试剂盒（Dako，丹麦），Trizol（Sigma，美国），逆转录试剂盒及PCR扩增试剂盒（Takara，日本），人胆管癌组织芯片（Abcam公司，英国）。石蜡切片机（Lieca，德国），DM4000正置光学显微镜（Lieca，德国），实时定量PCR仪（Bio-Rad，美国）。

1.2 动物实验方法

1.2.1 实验动物：选择体重220±250 g健康雄性SD大鼠，清洁级，12 h昼夜节律分笼饲养，自由饮食水。所有程序符合《中华人民共和国实验动物管理条例》及伦理要求。大鼠随机分为假手术组和胆管结扎（bile duct ligation，BDL）手术组，每组各10只。术后28天在2%异氟烷麻醉下放血处死大鼠，取肝脏分成约1 cm3大小，取2块肝组织浸于10%福尔马林溶液，其余肝组织置于-80℃冰箱储存备用。

1.2.2 形态学观察：大鼠肝组织样本常规石蜡包埋，切片，厚度 5 μm。HE 染色：苏木素染色 10 min，盐酸酒精分化数秒，温水返蓝；伊红染色2 min，自来水洗，脱水、透明、封片。免疫组化染色：按照试剂盒说明书操作，采用1 mol/L柠檬酸缓冲溶液（pH 6.0），高温高压10 min进行抗原修复；0.5%过氧化氢溶液室温孵育15 min，去除内源性过氧化物酶；封闭液室温孵育30 min，以封闭非特异性抗原；抗GREM1抗体按1∶50稀释，4℃孵育，过夜；阴性对照采用IgG代替一抗。DAB显色3～5 min，苏木素复染细胞核。常规脱水、透明、封片，显微镜下观察。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）：取大鼠肝组织于Trizol试剂中剪碎、研磨，抽取总RNA，逆转录为cDNA。PCR反应体系为20 μL，反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性10 s，55℃退火10 s，共40个循环，以无菌双蒸水代替cDNA作为阴性对照。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参，计算目的基因相对表达量。GAPDH上游引物序列为 5’-CCCACTAACATCAAATGGGG-3’；下游引物序列为 5’-ATCCACAGTCTTCTGGGTGG-3’。Gremlin 1上游引物序列为5’-AAGCGAGACTGGTGCAAAAC-3’；下游引物序列为 5’-CTTGCAGAAGGAGCAGGACT-3’。

1.3 统计学处理 应用GraphPad Prism 8.0统计学软件进行数据分析。计量资料以x¯±s表示，两组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验；Kaplan-Meier生存分析采用log-rank检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 GREM1基因在人体多种组织中表达水平 分别从3个通过RNA测序方法建立的数据库（FANTOM5、GTEx和HPA）中获取GREM1基因在多种人体组织中的表达数据，分析GREM1基因表达量排前10位的人体组织，其中人胆囊组织的表达最为丰富，其次是平滑肌、子宫（宫颈）、膀胱、结肠、直肠等组织。见图1。

2.2 GREM1在BDL大鼠肝组织中表达水平 HE染色显示，BDL组大鼠肝组织中肝细胞少见，胆管细胞增生，细胞排列紊乱，胆小管扩张，可见弥漫的胆小管形成；假手术组大鼠肝组织结构未见异常。免疫组化染色显示，BDL组大鼠肝组织胆管细胞Ⅰ型胶原蛋白阳性表达，细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白沉积明显；肝胆管细胞内GREM1蛋白染色呈强阳性，细胞外基质内可见少量GREM1蛋白沉积。假手术组大鼠肝组织未见明显的Ⅰ型胶原蛋白表达和沉积，未见GREM1蛋白表达。见图2。qRT-PCR检测显示，与假手术组大鼠相比，BDL手术组大鼠肝组织GREM1 mRNA表达显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.0001）。见图3。说明BDL手术可以导致胆汁淤积性肝纤维化，GREM1 mRNA和蛋白在纤维化肝胆管细胞内表达显著增加。

2.3 GREM1在人胆管癌组织中表达水平 利用Oncomine（https://www.oncomine.org）数据库中 cDNA芯片数据，对GREM1基因表达进行分析[12]。从Bittner Multi-cancer（GSE2109）中获取的实验数据分析显示，与健康对照组相比，胆管癌组织中GREM1基因表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.0001），提示GREM1基因在人胆管癌组织中表达增加。见图4。

图1 GREM1基因在人体多种组织中表达

图2 BDL大鼠肝组织HE染色及免疫组化染色

图3 BDL大鼠肝组织中GREM1 mRNA表达水平

图4 Oncomine数据库中GREM1基因在胆管癌组织中表达水平

为了进一步研究GREM1在胆管癌组织中的表达，我们利用免疫组化方法对胆管癌组织芯片染色，并与配对癌旁组织比较，采用Image J软件进行染色强弱评分，显示胆管癌组织中GREM1蛋白表达呈阳性，与配对的癌旁组织相比，胆管癌组织免疫组化染色评分显著增加，差异具有统计学意义（P＜0.0001）。见图 5。

图5 GREM1蛋白在人胆管癌组织及癌旁组织中表达

2.4 GREM1表达与患者临床病理学指标及预后的关系 以免疫组化评分的中位数为界，将84例CCA患者分为GREM1蛋白低表达组和高表达组。结果显示，GREM1蛋白表达与细胞分化、AJCC分级、淋巴结转移和TNM分期密切相关（P＜0.05），见表1。与低表达组相比，高表达组患者无病生存期及总体生存期显著缩短，差异均具有统计学意义（P＜0.05），见图6。

表1 GREM1表达与患者临床病理学指标关系 例

图6 GREM1表达与胆管癌患者预后关系

3 讨 论

胆管癌是仅次于肝细胞肝癌的最常见肝恶性肿瘤，约占胃肠道恶性肿瘤3%[2]。研究发现，原发性硬化性胆管炎、肝吸虫感染或胆管结石等引发的胆管慢性炎症状态是诱发胆管癌的重要危险因素，约50%原发性硬化性胆管炎患者在诊断后24个月内被再诊断为胆管癌[13]。目前手术是CCA唯一治疗方法，但大多数患者在诊断时已处于疾病后期，失去根治性手术机会。因此，深入了解胆管癌发病危险因素，加强对高危人群监测，尽量做到早诊断、早治疗，对提高患者生存率具有重要意义。

肝纤维化/硬化是胆管癌发病众多危险因素共有的疾病进展过程。越来越多的证据表明，慢性胆管损伤、增生以及纤维化基质微环境的共同作用诱导胆管癌发生[14]。BDL动物模型是研究胆道炎症、阻塞、胆汁淤积性肝纤维化/硬化等进行性肝损伤的经典模型[15]。本研究首先对3个不同数据库的研究数据进行分析，发现GREM1基因在人体胆囊组织高表达，因此推测该基因表达异常可能与人类胆囊或胆道疾病相关。另有研究表明，在肝纤维化进展过程中I型胶原在细胞外基质沉积逐渐增加，与其他基质蛋白共同调节胆管细胞增殖、迁移，最终发展为癌前病变[14]。我们利用大鼠BDL模型，在术后第28天肝组织切片上可见明显的胆管细胞增生和细胞外Ⅰ型胶原蛋白沉积，说明成功建立了胆管阻塞性肝纤维化模型。通过qRT-PCR和免疫组化法检测GREM1表达，发现纤维化大鼠肝组织中GREM1在mRNA和蛋白水平的表达均显著增加，表明GREM1表达异常与胆道阻塞性肝纤维化密切相关。

近年研究表明，GREM1在多种恶性肿瘤组织中表达增加，且与癌症进展和预后不良相关。在胰腺癌组织中，GREM1表达增加与生存率降低、TNM分期显著相关[16]。体外研究发现，敲减GREM1基因可以抑制结肠癌细胞增殖、迁移和上皮-间质转化[17]。乳腺癌组织活检也发现GREM1 mRNA在雌激素受体阴性乳腺癌组织中高表达，且与患者不良生存相关[18]。为研究GREM1在胆管癌中的表达及意义，我们从Oncomine数据库获取的Microarray研究数据表明，GREM1基因在胆管癌组织中表达显著上调。为进一步验证上述结果，我们检测胆管癌组织中GREM1蛋白表达情况，并分析GREM1蛋白表达与临床病理学特征及预后的相关性，结果表明胆管癌组织中GREM1蛋白表达显著增加，且与细胞分化、AJCC分级、淋巴结转移和TNM分期等密切相关，高GREM1蛋白表达患者预后不良，无病生存期及总体生存期显著缩短。GREM1在CCA发生发展中的具体作用机制还有待于进一步研究。

综上所述，GREM1在大鼠胆汁淤积性肝纤维化和人胆管癌组织中表达上调，提示GREM1可能参与胆汁淤积性肝纤维化向胆管癌进展的过程，有望成为胆管癌防治的潜在靶点，也可以作为判断胆管癌患者预后的指标。