虾青素通过抑制氧化应激延缓失神经肌萎缩*

孙嘉诚 ，杨晓明 ，仇嘉颖 ，张莉蕾 ，沈筠恬 ，孙华林

（1南通大学神经再生重点实验室，江苏226001；2南通大学杏林学院；3南通市妇幼保健院）

周围神经损伤是临床常见疾病，可引起神经元变性、肌肉萎缩和纤维化。临床修复长距离神经缺损时，由于神经再生速度慢，往往在再生神经还未到达靶肌时靶肌已发生不可逆的萎缩，严重影响靶肌功能重建效果[1]。因此，在周围神经损伤修复过程中，延缓骨骼肌萎缩至关重要[2-3]。本课题组前期通过转录组测序系统分析，发现骨骼肌失去神经支配后早期即发生氧化应激[4]。虾青素（Astaxanthin，AST）是一种非维生素A原的类胡萝卜素，具有极强的抗氧化能力[5]。本研究采用小鼠坐骨神经离断方法建立失神经肌萎缩模型，分析虾青素对失神经肌萎缩的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物实验 成年ICR健康小鼠，体重20±2 g，由南通大学实验动物中心提供，随机分为虾青素低剂量组、中剂量组、高剂量组、假手术组、阴性对照组，每组6只小鼠。腹腔注射复合麻醉剂麻醉小鼠，分离并暴露坐骨神经，在股骨段作1 cm长度的坐骨神经缺损，然后消毒、缝合。虾青素低剂量组：坐骨神经离断小鼠每天腹腔注射AST 12.5 mg·kg-1；虾青素中剂量组：坐骨神经离断小鼠每天腹腔注射AST 25mg·kg-1；虾青素高剂量组：坐骨神经离断小鼠每天腹腔注射 AST 50 mg·kg-1；假手术组（正常对照组）：暴露坐骨神经后缝合伤口，每天注射等体积生理盐水；阴性对照组（失神经组）：坐骨神经离断小鼠每天腹腔注射等体积生理盐水。各组小鼠连续腹腔注射14天，14天后收集每只小鼠后肢两侧胫前肌并称重，根据实验需要选择不同的保存方式。

1.2 免疫荧光染色 4%多聚甲醛灌注固定小鼠，取出完整胫前肌，经10%、20%、30%蔗糖依次梯度脱水后，取肌肉中三分之一包埋于OCT中行冰冻切片，切片8 μm厚。经封闭后的切片和层粘连蛋白（laminin）一抗孵育过夜，次日PBS清洗切片，然后将切片和相应的二抗室温孵育1～2 h。PBS清洗，封片液封片，烘片后使用蔡司显微镜拍照。

1.3 qRT-PCR检测 采用Trizol试剂提取肌肉总RNA，根据试剂盒操作说明合成第一链cDNA，然后根据下列引物执行qRT-PCR分析。小鼠NRF2 F：GTTGCCCACATTCCCAAACA，R：CTGATGAGGGGCAGTGAAGA；小鼠 NQO1 F：AGGATGGGAGGTACTCGAATC，R：TGCTAGAGATGACTCGGAAGG；小鼠NOX2 F：GATGATAGCACTGCACACCG，R：ATTCCTGTGATCCCAGCCAA；小鼠 NOX4 F：TGCTCATTTGGCTGTCCCTA，R：TGCAGTTGAGGTTCAGGACA；小鼠 β-actin F：CCTCTATGCCAACACAGTGC，R：CCTGCTTGCTGATCCACATC。mRNA相对表达变化参照2-ΔΔCt方法计算[6]。

1.4 Western Blot检测 采用蛋白裂解液提取肌肉总蛋白，BCA试剂盒（碧云天）测定蛋白浓度，取30μg总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，湿转法将凝胶上蛋白转至PVDF膜上，封闭液封闭，1 h后取相应一抗和PVDF膜孵育过夜。次日以TBST漂洗PVDF膜3次，然后PVDF膜和相应二抗室温孵育，1 h后TBST漂洗PVDF膜3次，加适量发光液（避光），最后通过扫膜仪进行扫膜分析。

1.5 透射电子显微镜观察 透射电镜可用于观察骨骼肌超微结构，尤其是线粒体的变化。方法参照之前发表的文献[7]。麻醉处死小鼠后，小心取下需要检测的肌肉，修裁至适当大小，立即固定在2.5%戊二醛中，4℃保存。通过透射电子显微镜（HT7700，日立，日本）观察肌肉切片。

1.6 统计学处理 采用GraphPad Prism软件进行数据分析。计量资料采用单因素方差分析，然后采用Tukey多重比较检验比较各组间的差异。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 虾青素缓解失神经引起的骨骼肌萎缩 各组小鼠经2周处理后分析患侧与健侧胫前肌湿重比，结果显示阴性对照组胫前肌湿重比显著低于正常对照组（P＜0.05），说明失神经肌萎缩模型建立成功。虾青素处理组胫前肌湿重比显著高于阴性对照组，说明AST可以减轻失神经支配引起的骨骼肌萎缩，且存在剂量依赖性，AST高剂量组对失神经肌萎缩的保护效果最佳（图1）。为了进一步研究AST对失神经肌萎缩的影响，我们通过层粘连蛋白免疫荧光染色，发现阴性对照组肌纤维横截面积显著小于正常对照组，表明失神经支配后肌纤维横截面积显著下降。AST低剂量组肌纤维横截面积虽大于阴性对照组，但无统计学意义；AST中剂量组和高剂量组肌纤维横截面积均显著大于阴性对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示AST对失神经引起的肌纤维横截面积减小具有保护作用，且高浓度AST的保护效果最佳（图2）。

图1 虾青素缓解失神经支配后胫前肌湿重比下降

2.2 虾青素抑制泛素蛋白酶体水解 由于高剂量虾青素具有较好的防治失神经肌萎缩的效果，为了进一步探讨虾青素的可能机制，我们检测高剂量AST干预后泛素蛋白酶体水解系统在失神经肌萎缩过程中的激活情况。研究发现肌肉特异性泛素连接酶MAFbx和MuRF1在阴性对照组胫前肌中的表达显著高于正常对照组，提示失神经支配后骨骼肌中泛素蛋白酶体水解系统被显著激活，增强了蛋白降解能力；AST处理可以显著降低MAFbx和MuRF1表达，提示AST抑制失神经支配后胫前肌中泛素蛋白酶体水解系统的激活，从而降低蛋白水解能力。肌球蛋白作为骨骼肌纤维内主要的收缩蛋白和调节蛋白，肌球蛋白重链（MyHC）是肌球蛋白重要组成成分[8]，依据肌肉中MyHC表达水平可以判断肌肉蛋白的降解情况。本研究发现，肌球蛋白重链MyHC在阴性对照组中的表达显著低于正常对照组，而AST处理组中MyHC的表达显著高于阴性对照组（图3），这可能是由于泛素连接酶MAFbx和MuRF1的表达变化所引起，表明虾青素通过抑制泛素蛋白酶体水解，减少肌球蛋白的降解来延缓失神经骨骼肌萎缩。

图2 虾青素缓解失神经支配后胫前肌肌纤维横截面积下降

图3 虾青素可抑制泛素蛋白酶体水解

2.3 虾青素减轻失神经支配引起的线粒体自噬 有研究表明自噬在肌萎缩过程中发挥重要作用[9]。我们通过电镜观察发现，与正常对照组相比，靶肌失神经支配后大量线粒体出现空泡变性和自噬，同时伴随自噬相关蛋白ATG7和BNIP3的显著高表达（图4）。AST处理后，靶肌线粒体空泡变性和自噬现象显著受到抑制，同时ATG7和BNIP3表达下降（图4），表明虾青素可能通过下调失神经支配靶肌中自噬相关蛋白的表达来缓解线粒体自噬，从而延缓失神经肌萎缩。

图4 虾青素可减轻骨骼肌因失神经支配引起的线粒体自噬

2.4 虾青素抑制失神经支配靶肌中氧化应激反应 以往有研究发现高水平的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可引起蛋白质水解、肌细胞凋亡，最终引起骨骼肌萎缩[10-12]。本研究发现在失神经支配胫前肌中抗氧化相关基因NRF2、NQO1表达显著下降，而与ROS产生相关基因Nox2、Nox4表达显著上升；AST处理可显著逆转NRF2、NQO1基因表达的下降和Nox2、Nox4基因表达的上升（图5），提示虾青素缓解失神经肌萎缩可能通过抑制氧化应激反应而发挥作用。

图5 虾青素可抑制失神经支配靶肌中的氧化应激反应

3 讨 论

失神经肌萎缩在临床上非常常见，迄今为止尚无较好的防治方法，其原因主要是因为关于失神经肌萎缩的分子机制仍不明确[13]。我们先前的研究表明，失神经肌萎缩可分为四个不同阶段，即氧化应激阶段、炎症阶段、萎缩阶段和萎缩纤维化阶段，而氧化应激在骨骼肌失神经支配后的早期就被激活，提示氧化应激信号可能在其中发挥重要的早期触发作用[4]。因此，本研究探讨具有抗氧化作用的虾青素是否可以缓解失神经肌萎缩。

本研究结果显示，虾青素抑制失神经支配后胫前肌的萎缩，主要表现为抑制了胫前肌湿重比和肌纤维横截面积的减小。蛋白水解系统激活在肌萎缩过程中发挥至关重要作用[14]，泛素蛋白酶体水解系统在失神经、废用、肿瘤恶病质、糖尿病和各种慢性炎症引起的肌萎缩过程中显著激活，参与多种肌肉蛋白的水解[15-18]。泛素连接酶MAFbx和MuRF1是两种肌肉特异性E3泛素连接酶，在多种肌萎缩模型中表达增加，是重要的肌萎缩标志物[19]。Nowak等[20]报道，MuRF1在肌球蛋白重链MyHC降解过程中发挥重要作用。本研究显示，虾青素可抑制失神经支配后靶肌中泛素连接酶MAFbx和MuRF1的增加，同时伴随肌球蛋白重链MyHC表达的增加，从而减轻失神经肌萎缩，提示虾青素可能通过抑制泛素蛋白酶体水解系统来缓解失神经肌萎缩。

ROS可能触发泛素连接酶MuRF1和MAFbx在肌细胞中的表达[21-22]。Nox4是氧化应激的主要来源，抑制Nox4表达可以显著抑制MuRF1和MAFbx的表达，进而减轻肌萎缩[23]。转录因子NRF2及其靶基因可以保护细胞由于暴露ROS引起的损伤[24-25]。我们研究发现，虾青素可上调转录因子NRF2及其靶基因NQO1，下调ROS产生相关因子Nox2、Nox4的表达。由此可见，虾青素可能通过抑制氧化应激反应，降低泛素连接酶MAFbx和MuRF1的表达，进而减轻肌球蛋白重链MyHC降解，从而减轻失神经肌萎缩。

研究表明自噬在机体内维持平衡状态尤为重要，过度自噬会导致骨骼肌萎缩[26]。自噬在脊髓性肌萎缩症以及失神经肌萎缩过程中发挥重要作用，抑制自噬可以有效缓解肌萎缩，可见自噬是治疗肌萎缩的一个关键靶点[27-31]。我们的研究显示，虾青素可显著抑制靶肌由于失神经引起的线粒体自噬，同时伴随自噬相关蛋白ATG7和BNIP3的表达下降。有研究表明，ROS可能通过激活活性氧感受器、促进溶酶体钙释放，进而诱导自噬[32]。虾青素抑制靶肌失神经支配后的自噬可能通过抑制ROS，进而抑制自噬相关基因的表达，减轻线粒体自噬，从而发挥失神经肌萎缩的保护作用。

综上所述，本研究进一步证实氧化应激反应在失神经肌萎缩过程中的重要作用。虾青素可通过抑制氧化应激反应，来减轻线粒体自噬，抑制泛素蛋白酶水解，进而缓解失神经肌萎缩。本研究不仅丰富了失神经肌萎缩的分子调控机制，还为虾青素作为防治肌萎缩的保护性药物提供科学依据。