独圣活血片中8种成分的含量测定及聚类分析、主成分分析

孙德国，梁 璇，马灵珍(.辽宁中医药大学附属医院药学部，沈阳 0032；2.亳州职业技术学院药学院，亳州 236800)

独圣活血片由三七、醋延胡索、当归、鸡血藤、大黄、香附(四炙)和甘草7味中药材制成，主治跌打损伤、瘀血肿胀以及气滞血瘀所致的痛经，现收载于《中国药典》2015年版一部[1]，质量标准和文献报道[2]仅对该制剂所含三七皂苷R1和人参皂苷Rg1进行了定量检测。现代研究表明，独圣活血片联合双氯芬酸钠可有效改善患者临床症状和机体血液流变学指标，促进肢体功能恢复[3]，对软组织损伤疗效显著[4]；其联合五子衍宗丸可增加月经量过少患者的月经量与持续月经周期，对肾虚血瘀型月经过少症具有良好的治疗效果[5]。中药及其制剂所含成分复杂，药材中主要成分受产地、采收季节以及炮制加工方法等多种因素的影响，单味药材所含成分不能全面反映中药及其制剂，尤其是中成药复方制剂的整体质量，多指标成分评价模式已逐步应用于其质量控制中，同时通过聚类分析和主成分分析等化学计量学分析方法，将多指标成分评价模式提供的数据信息进行充分整合，有利于揭示中药及其制剂复杂成分间隐藏的规律，避免综合评价时主观加权的弊端。独圣活血片方中三七散瘀止血、消肿定痛，醋延胡索活血、行气、止痛，共为君药；当归和鸡血藤活血补血、调经止痛，大黄逐瘀通经、泻下攻积，合为臣药；香附(四炙)理气宽中、调经止痛，为佐药；甘草缓急止痛、调和诸药，为使药。7味中药所含成分相互协同、互相制约，共奏活血消肿、理气止痛之功。为了确保产品质量和临床疗效的稳定性，本实验根据“君臣佐使”中医配伍理论，采用HPLC法对独圣活血片中君药醋延胡索主要活性成分延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱，臣药鸡血藤代表性成分儿茶素、表儿茶素和美迪紫檀素，佐药香附(四炙)主要活性成分香附烯酮和α-香附酮的含量进行同时测定，建立独圣活血片多指标成分质量控制模式，并采用SPSS 26.0统计软件对所测8种成分的含量进行聚类分析和主成分分析，有助于药品生产企业和监管部门不断完善该制剂的质量控制标准，为控制该制剂的整体质量提供参考。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Sartorius BP211D型电子天平(德国Sartorius公司)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 延胡索乙素(质量分数为99.8%，批号110726-201819)、儿茶素(质量分数为99.2%，批号110877-201604)、表儿茶素(质量分数为99.7%，批号110878-201703)和α-香附酮对照品(质量分数为99.4%，批号110748-202016)，均购于中国食品药品检定研究院；紫堇碱(质量分数为99.9%，批号PRF10022126)和四氢小檗碱对照品(质量分数为98.8%，批号 PRF8050941)，购于成都普瑞法科技开发有限公司；美迪紫檀素(质量分数为100.0%，批号18040322)和香附烯酮对照品(质量分数为95.5%，批号18051522)，购于上海同田生物技术股份有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。独圣活血片(薄膜衣片，批号：1904003，1905004，1905005，1906006，1909009，1909010，2003001，编号分别为S1～S7；糖衣片，批号：1908012，1910014，1911018，编号分别为S8～S10)，均购于太极集团四川绵阳制药有限公司。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液 精密称取8种成分对照品各适量，用体积分数为70%的乙醇制成质量浓度分别为0.592，0.484，0.356，1.094，1.258，0.116，1.452，0.716 mg·mL-1的混合对照品储备液。精密吸取上述混合对照品储备液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0 mL，分别用体积分数为70%的乙醇稀释至20 mL，制成系列质量浓度的线性混合对照品溶液Ⅰ～Ⅵ；取线性混合对照品溶液Ⅳ作为混合对照品溶液(8种成分质量浓度分别为29.6，24.2，17.8，54.7，62.9，5.8，72.6，35.8 μg·mL-1)。

2.3线性关系考察 精密吸取2.1.1项下制备的线性混合对照品溶液Ⅰ～Ⅵ各10 μL，按照2.2项下色谱条件进样测定独圣活血片中8种成分的峰面积，分别以8种成分质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，得8种成分的回归方程及线性范围，见表1。

2.1.3阴性样品溶液 按照独圣活血片质量标准[1]项下处方工艺，分别制备缺香附(四炙)、鸡血藤和醋延胡索的阴性样品，再按照2.1.2项下方法制成阴性样品溶液。

2.10主成分分析 以表3中8种成分的含量测定结果为变量，采用SPSS 26.0软件对10批独圣活血片的含量数据进行主成分分析，计算相关系数的特征值和方差贡献率，结果见表4。依据累积方差贡献率大于85.000%的原则，以初始特征值大于1为提取标准，由表4可知，前3个主成分初始特征值为3.281，1.882，1.794，均大于1，对应的方差贡献率分别为41.009%，23.528%，22.426%，累积方差贡献率为86.962%，大于85.000%，表明提取前3个主成分即可代表独圣活血片8种成分86.962%的信息，可用于独圣活血片的质量评价。

2.6稳定性考察 按照2.1.2项下方法临用新配1份供试品溶液，于0，3，6，12，18，24 h进样检测8种成分的峰面积，结果8种成分峰面积的RSD值分别为0.69%，0.93%，1.05%，0.57%，0.71%，1.12%，0.60%，1.02%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.2供试品溶液 取独圣活血片，除去包衣后研成细粉，精密称取1.0 g，加入体积分数为70%的乙醇25 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷后用体积分数为70%的乙醇补足减失的质量，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

表1 8种成分的回归方程和线性范围

图1 HPLC图

2.8样品的含量测定 取10个批次(编号S1～S10)独圣活血片，按照2.1.2项下方法制成供试品溶液，各批次平行制备3份，按照2.2项下色谱条件进样检测8种成分的峰面积并计算含量，结果见表3。

2.7回收率实验 取8种成分含量均已知的独圣活血片适量，除去包衣，研成细粉，精密称取0.5 g，共9份，每3份为1组，依据《中国药典》2015年版四部规定(对照品加入量为样品原有量的50%，100%，150%)，分别精密加入混合对照品溶液(已知样品含量，根据2.1.1项下方法另行配制，8种成分质量浓度分别为0.326，0.258，0.192，0.622，0.754，0.068，0.892，0.406 mg·mL-1)0.5，1.0，1.5 mL，再按照2.1.2项下方法制成加样供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样测定8种成分的峰面积并计算含量，平均回收率及RSD值见表2。

2.2色谱条件 采用Waters SunFire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，柱温：30 ℃。流动相：乙腈(A)-1 mL·L-1冰醋酸(B)，梯度洗脱(0～14.0 min，18.0%A；14.0～26.0 min，18.0%A～23.0%A；26.0～40.0 min，23.0%A～54.0%A；40.0～57.0 min，54.0%A～81.0%A；57.0～65.0 min，81.0%A～14.0%A)。流速：0.9 mL·min-1；进样量：10 μL；检测波长分别为242 nm (0～26.0 min检测香附烯酮和α-香附酮)[6-9]，280 nm(26.5～65.0 min检测儿茶素、表儿茶素、美迪紫檀素、延胡索乙素、紫堇碱和四氢小檗碱)[10-17]。精密吸取2.1项下制备的混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μL，进样检测，结果供试品溶液色谱图中8种成分色谱峰峰形对称，分离度均大于1.5，理论板数按照各成分色谱峰计算均≥4 500，阴性样品对8种成分的含量测定无干扰，见图1。

基于STM32的嵌入式远程视频监控系统设计………………………………马跃辉, 冀保峰, 程一淼,等(52)

2.5重复性考察 取独圣活血片，按照2.1.2项下方法制成6份供试品溶液，按照2.2项下色谱条件进样分析，记录8种成分的峰面积并计算含量，结果8种成分含量的RSD值分别为1.46%，0.62%，1.76%，1.01%，0.93%，1.85%，0.87%，1.36%，表明实验重复性良好。

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表2 回收率实验结果 (n=9)

2.4精密度考察 取2.1.1项下制备的混合对照品溶液，按照2.2项下色谱条件连续进样6次，测得8种成分峰面积的RSD值分别为0.74%，0.82%，1.01%，0.63%，0.59%，1.06%，0.55%，0.98%，表明仪器精密度良好。

表3 独圣活血片中8种成分的含量测定结果

2.9聚类分析 为考察不同批次独圣活血片中8种成分的含量差异，本实验采用SPSS 26.0软件系统聚类分析法(聚类方法：组间连接；测量区间：欧氏距离)对10个批次的独圣活血片进行聚类分析，结果见图2。由图2可知，当类间距离为20时，10批样品可聚为2类，样品S1、S3、S2、S5、S7、S6和S4聚为第一类，样品S8、S10和S9聚为第二类。从分类结果可知，独圣活血片薄膜衣片聚为一类，糖衣片聚为一类，同一类型独圣活血片质量相对稳定，可能与不同类型片剂的生产工艺控制参数差异以及不同批次间产品所用原药材的批间差异有关。

图2 聚类分析树状图

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表4 特征值和方差贡献率

3 讨论

3.1流动相的选择 本实验在选择流动相时，分别考察了甲醇-水[7，10-11，18]、乙腈-1 mL·L-1磷酸[12]、乙腈-1 mL·L-1甲酸[13-14]和乙腈-1 mL·L-1冰醋酸[19-20]4个流动相体系。结果显示，以乙腈-1 mL·L-1冰醋酸为流动相进行梯度洗脱时基线平稳，8种成分色谱峰的分离度及对称度最佳，通过对流动相比例的不断优化，最终采用2.2项下的流动相及梯度洗脱程序对独圣活血片中8种成分的含量进行同时检测。

3.2供试品处理方法的选择 本实验分别考察了不同提取溶剂(甲醇[6-7，10，18]、体积分数为95%的乙醇、体积分数为70%的乙醇[12，19]和体积分数为50%的乙醇[20-21])、不同提取方法(超声提取[6-7，10，18]和加热回流提取[12-13，19])对独圣活血片中8种成分综合提取率的影响，结果显示，以体积分数为70%的乙醇超声提取时，8种成分的综合提取率较高，杂质成分干扰较小。同时对提取时间不断摸索，最终确定采用体积分数为70%的乙醇超声提取30 min制备供试品溶液。

一方面，传统的数据库实验教学，一般采用教师先行讲授理论知识，学生再上机练习的模式。理论与实验学时分开进行，表面上看是理论与实践相结合的形式，但是学生在学习理论知识后，没能及时地进行上机操作，在一定程度上弱化了对理论知识的理解，而且会为后续的上机操作制造困难，降低整体的学习效率。因此，在教学过程中，需要实验内容与理论内容同时进行，每节课都要留出适当的时间，让同学们进行实践操作。

本实验通过对独圣活血片中主要药效成分延胡索乙素、紫堇碱、四氢小檗碱、儿茶素、表儿茶素、美迪紫檀素、香附烯酮和α-香附酮含量的同时测定，建立了该制剂的多指标成分质量控制模式，同时采用聚类分析、主成分分析等化学计量学手段对不同企业生产的10批复方独圣活血片质量进行了综合评价。所建立的方法操作简便、结果准确，为全面、科学地评价独圣活血片整体质量提供了参考。