硫化氢介导大蒜提取物对变应性鼻炎大鼠的治疗作用

肖文浚，宋百灵，李心雨，李金芳，姜孝芳，李新霞*(.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 800；.新疆埃乐欣药业有限公司，乌鲁木齐 800；.新疆医科大学厚博学院，克拉玛依 84000；4.新疆医科大学中心实验室，乌鲁木齐 800)

硫化氢是生物体内的内源性气体信号分子，不仅在神经[1]、心血管[2]和消化系统[3]中有重要作用，还参与呼吸的生理调节及病理过程，对急慢性呼吸疾病有治疗作用[4]。支气管哮喘患者急性发作期血浆硫化氢水平明显低于临床缓解期，且随着病情恶化，血浆硫化氢水平逐渐降低[5]。慢性阻塞性肺病(COPD)患者血清中硫化氢水平较健康者低，在COPD稳定期患者血清中硫化氢水平有所升高[6]。

研究表明，大蒜辣素及其系列降解大蒜含硫化合物在体内的生物活性作用是经硫化氢介导的[7]。本课题组前期研究了大蒜含硫化合物，包括蒜氨酸、大蒜辣素、二烯丙基硫化物(DAS)、二烯丙基二硫化物(DADS)和三硫二丙烯(DATS)在大鼠血液中的代谢、分布及药代动力学，体内实验进一步证实硫化氢是大蒜辣素在体内的代谢产物，大蒜含硫化合物有望成为硫化氢的供体药物[8-9]。

我国民间有用大蒜治疗鼻炎的经验方[10-11]，对感冒后鼻塞不通等有较好疗效。Peter J[12]报道，大蒜辣素对变应性鼻炎(AR)效果显著。本实验所用大蒜提取物是将鲜蒜冷冻干燥制得的冻干蒜粉，保留了大蒜中除水分外的所有原始成分和蒜酶的活性，大鼠给药前将大蒜提取物用蒸馏水配制成混悬液，此时大蒜中的蒜氨酸与蒜酶全部反应转化为大蒜辣素。本研究建立AR大鼠模型，考察大蒜含硫化合物对AR大鼠的行为学表现、血清免疫球蛋白E(IgE)等生化指标及鼻黏膜病理组织的影响，以阐明大蒜含硫化合物对AR的作用及其可能的机制。

1 仪器与材料

1.1仪器 C2500-R-230V型高速离心机(美国莱伯特公司)；ICV-450型电热恒温培养箱(日本亚速旺公司)；Multiskan MK3型全自动酶标仪[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；ACQUITY UPLC型超高效液相色谱仪，ACQUITY®TQD型质谱仪(美国沃特世公司)；5000 MWCO PES型超滤离心管(德国赛多利斯公司)。

1.2试药 大蒜提取物(批号20161201，蒜氨酸质量分数为3.9%，潜在大蒜辣素质量分数为1.8%)，蒜氨酸(批号20081201，质量分数为92%)，新疆埃乐欣药业有限公司；鼻炎康片(批号16070)，国药集团德众(佛山)药业有限公司；卵清蛋白(OVA)，戊巴比妥钠(批号 20160925)，美国Sigma公司；氢氧化铝胶生理盐水(批号20170309)，青海生物药品厂有限公司；大鼠IgE、白细胞介素-5(IL-5)和白细胞介素-13(IL-13)酶联免疫吸附(Elisa)试剂盒以及一氧化氮(NO)检测试剂盒，均购于Elabscience公司；大鼠嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(ECP)Elisa试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；硫化钠(批号20111009)，甲酸(批号20141209)和N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐(批号20140504)，均购于天津市福晨化学试剂厂；乙酸锌(批号20110103)，天津静海大邱工业园；三氯化铁(批号20111008)，天津市盛奥化学试剂有限公司；亚甲基蓝(批号20120725)，天津永晟精细化工有限公司。

1.3动物 SPF级雄性SD大鼠72只，体质量为180～220 g，由新疆医科大学动物实验中心提供。实验动物许可证号：SCXK(新)2016-0003。

2 方法

2.1AR大鼠分组、建模与给药 将大鼠随机分为6组：空白组、模型组、阳性对照组以及大蒜提取物低、中、高剂量组，每组12只，每笼6只。采用OVA致敏的方法造模，OVA作抗原，氢氧化铝作佐剂，将OVA溶解于氢氧化铝胶生理盐水制成混悬液，每只大鼠用1 mL质量浓度为0.3 g·L-1的OVA生理盐水腹腔注射，隔日1次，共10次，为基础致敏。完成基础致敏的次日用质量浓度为50 g·L-1OVA的生理盐水滴鼻攻击双侧鼻腔，每侧50 μL，每日1次，共12次，行为学评分总分超过5分即为造模成功。空白组用生理盐水代替OVA进行腹腔注射和滴鼻攻击。

造模完成后开始给药，各剂量组药液临用现配。大蒜提取物低、中、高剂量组给药量以蒜氨酸计分别为3.15，6.30，12.60 mg·kg-1，阳性对照组给予鼻炎康药量为466 mg·kg-1，按照每100 g灌胃1.0 mL给予药液；空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水。除空白组外，其余各组每次给药前30 min均用质量浓度为50 g·L-1的OVA生理盐水进行双侧滴鼻，每侧50 μL，连续给药10 d；空白组用等量生理盐水滴鼻。

2.2行为学观察 每次鼻腔致敏后行为学观察30 min，记录大鼠鼻涕量、喷嚏及鼻痒次数，采用叠加法记分，评分标准见表1，总分超过 5分者为造模成功。隔日记录大鼠行为学得分，计算总分。

表1 大鼠AR症状评分标准

2.3样品采集与测定

2.3.1样品的采集 血清采集：药物干预结束后，禁食12 h，称定大鼠体质量，以质量浓度为20 g·L-1的戊巴比妥钠麻醉，取腹主动脉血3～4 mL，以3 000 r·min-1离心15 min，取上层血清，置于-80 ℃保存。鼻黏膜取样：麻醉大鼠取血后处死，取鼻中隔黏膜，置于体积分数为4%的甲醛中固定。其他组织取样：处死大鼠后，取心脏、肝小叶、脾脏、左肺、左肾和脑组织各0.2 g，置于冻存管中，-80 ℃保存。

2.3.2血液指标检测 取血清样本，用Elisa法分别检测IgE、ECP、IL-5及IL-13水平。按照试剂盒说明书检测NO水平。

2.3.3鼻黏膜病理组织学 鼻中隔黏膜组织脱钙处理72 h，脱水、包埋、切片、烤片，苏木精-伊红(HE)染色，高倍镜下观察组织学变化。

2.3.4大鼠血清及各组织中硫化氢水平的测定 采用UPLC-MS/MS法测定大鼠血清与组织中硫化氢的水平[8]。

2.3.4.1色谱条件 色谱柱为Waters ICQUITY UPLCBEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：1 mL·L-1甲酸-乙腈(47∶53)；柱温：40 ℃；流速：0.15 mL·min-1；进样量：2 μL。

2.3.4.2质谱条件 质谱离子化方式为电喷雾离子化(ESI)，离子极性为正离子；毛细管电压：3 kV；锥孔电压：20 V；离子源温度：150 ℃；脱溶温度：350 ℃；氩气流速：50 L·h-1；氮气流速：598 L·h-1。

2.3.4.3血液前处理 取血液样品，离心，取上清液100 μL，加乙腈200 μL，涡旋混匀，离心10 min，取上清液250 μL，置于超滤离心管中，离心，取超滤液100 μL，按照文献方法[8]依次加醋酸锌、N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐和三氯化铁，涡旋，室温静置，用UPLC-MS/MS法进行分析。

2.3.4.4组织样品前处理 取大鼠组织0.1 g，置于2 mL离心管中，加生理盐水450 μL，匀浆离心，取上清液100 μL，加乙腈200 μL，涡旋混匀，离心，取上清液250 μL，置于超滤离心管中，离心，取超滤液100 μL，依次加醋酸锌、N，N-二甲基对苯二胺盐酸盐和三氯化铁各100 μL，涡旋，室温静置，用UPLC-MS/MS法进行分析。

2.3.4.5扫描方式及定量离子选择 分别进行大鼠空白血清和给药后含药血清、组织样品的一级和二级质谱选择性扫描。样品中硫化氢衍生化生成稳定的亚甲蓝，其一级电离产生的碎片离子的相对分子质量为283.81，但衍生化试剂对生成的亚甲蓝有干扰。该碎片离子进一步二级电离产生相对分子质量分别为268.27，240.28的2个碎片离子，但相对分子质量为240.28的碎片离子进行定量时仪器响应较小，故采用二级质谱选择性扫描(MRM)，选择m/z=268.27为定量离子。

3 结果

3.1对AR大鼠行为的影响 造模阶段除空白组外，其他各组大鼠在第8次鼻腔给予OVA后，均出现抓鼻、流涕等AR症状，第12次滴鼻后，空白组、模型组、阳性对照组以及大蒜提取物低、中、高剂量组行为学评分分别为(1.3±0.4)，(6.3±1.3)，(6.8±1.1)，(6.8±1.1)，(6.7±1.4),(6.2±1.3)分，各造模组总分均大于5分，与空白组比较差异均具有统计学意义(P<0.01)，提示造模成功。给药6～10 d后，大蒜提取物低、中、高剂量组和阳性对照组大鼠AR症状均较模型组轻，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。给药第10天，大蒜提取物低、中和高剂量组几乎无鼻涕，仅有轻微抓鼻动作，偶见喷嚏，而阳性对照组仍有少量清涕，轻微抓鼻动作，偶见喷嚏。

表2 大蒜提取物给药对AR大鼠鼻部症状评分的影响

3.2对AR大鼠血清IgE、ECP、IL-5、IL-13和NO水平的影响 见表3。由表3可知，模型组血清中IgE水平明显高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组和大蒜提取物中剂量组血清中IgE水平均较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)；大蒜提取物低、高剂量组血清IgE水平与模型组相比略有下降，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组血清中ECP水平明显高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组和大蒜提取物低剂量组血清ECP水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)，说明血清中ECP的释放被明显抑制；大蒜提取物中、高剂量组血清中ECP水平略低于模型组，差异无统计学意义(P>0.05)。模型组血清IL-5和IL-13水平明显高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组和大蒜各剂量组血清IL-5与IL-13水平均低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.01)，说明阳性对照组和大蒜提取物低、中、高剂量组的血清IL-5与IL-13水平均明显降低，其中大蒜提取物低剂量组IL-5水平相对模型组降幅最大，达60.2%。模型组NO水平明显高于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)；阳性对照组和大蒜提取物低剂量组NO水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；大蒜提取物中、高剂量组NO水平与模型组相比略有降低，差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 大蒜提取物给药对AR大鼠血清IgE、ECP、IL-5、IL-13和NO水平的影响

3.3对AR大鼠鼻黏膜病理组织学的影响 见图1。由图1可知，空白组大鼠仅见少量鼻黏膜充血及腺体增生，鼻黏膜下固有层内偶见嗜酸性粒细胞(EOS)；模型组大鼠鼻黏膜充血，血管扩张，腺体增生，炎性细胞浸润明显，鼻黏膜下固有层内有大量EOS；阳性对照组大鼠鼻黏膜病理学改变均有所减轻，可见散在的炎性细胞和EOS；大蒜提取物低、中、高剂量组大鼠鼻黏膜组织病理学改变均减轻，可见散在的炎性细胞和EOS。

图1 组织病理学染色(HE，×400)

3.4AR大鼠血清及各组织中硫化氢水平 末次给药后,取空白组和大蒜提取物高剂量组大鼠的血清、心、肝、脾、肺、肾和脑组织，用UPLC-MS/MS法测定硫化氢水平，结果见表4。由表4可知，2组大鼠血清、心、肝、脾和肾中硫化氢水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)；大蒜提取物高剂量组的肺和脑组织中硫化氢水平均高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 末次给药后大蒜提取物高剂量组与空白组血清及各器官中硫化氢水平比较

4 讨论

本研究采用AR模型大鼠研究大蒜提取物对AR的作用，病理组织结果表明，各给药组与模型组大鼠相比，鼻黏膜充血、血管扩张、腺体增生和炎性细胞浸润程度均有明显改善。

AR是机体暴露于变应原后由IgE介导的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病。IgE是在AR发病的病理、生理过程中起关键作用的特异性抗体[13-14]，抑制IgE的产生并降低其水平是治疗AR的重要手段。本实验结果显示，给予大蒜提取物后血清IgE水平降低，鼻炎症状改善。EOS浸润是Ⅰ型变态反应的重要特征，EOS的生物学功能主要通过其脱ECP等颗粒实现，AR患者的EOS代谢活性增强导致血清中ECP水平增高[15]。本研究中，给药后的大鼠鼻黏膜病理切片明显观察到EOS减少，同时检测到血清ECP水平下降，说明大蒜提取物可抑制EOS的募集从而改善炎症反应。AR是由辅助性T细胞1/辅助性T细胞2(Th1/Th2)免疫反应失衡引起的Ⅰ型变态反应，IL-5和IL-13属于Th2细胞因子，是免疫反应的特异性指标[16]，给予大蒜提取物后，IL-5和IL-13水平均降低，通过AR的负向调节恢复了Th1/Th2免疫平衡。研究发现，AR等许多Ⅰ型变态反应疾病局部及全身血液中NO水平均升高[17]，NO在AR速发和迟发相反应中均起重要的促炎作用[18]。本实验结果表明，大蒜提取物能抑制诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达产生NO，减轻AR炎症程度。

目前，国内外公认的大蒜活性成分是大蒜辣素及其系列含硫有机化合物[19]。课题组前期实验表明，大蒜辣素尾静脉注射给药后在小鼠体内未测到原型，但可测到其代谢指标成分硫化氢，其药动学参数K=0.086 min-1，t1/2=8.926 min，tmax=15.000 min[8]，本实验采用大蒜提取物，蒜氨酸质量分数为3.9%，口服给药时已转化为大蒜辣素，于大蒜提取物末次给药20 h后取大蒜提取物高剂量组大鼠，采用UPLC-MS/MS法测定各组织中硫化氢的水平，其肺和脑组织中硫化氢水平均高于空白组，差异具有统计学意义。文献报道，在肺组织及肺血管中胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的表达较高[20]，可催化裂解含硫化合物产生的硫化氢高于其他组织，也提示大蒜提取物对呼吸系统疾病有较好的预防和治疗作用。研究表明，外源性硫化氢能降低哮喘小鼠肺泡灌洗液中IL-5、IL-13和EOS等炎性细胞的水平[21]。Rose P等[22-23]综述近几年研究人员已经公认的大蒜含硫化合物在体内通过硫化氢介导作用于多个通道，如离子通道、转录因子和蛋白激酶等，发挥抗炎与免疫调节作用。根据硫化氢药代动力学结果，结合文献推测大蒜提取物中的大蒜辣素在体内产生硫化氢，通过降低IL-5和IL-13等促炎因子水平、抑制iNOS-NO通路，发挥抗炎、抗氧化应激和免疫调节作用，从而减轻AR症状。

AR是机体免疫系统针对外部刺激而产生的气道炎症变态反应，使用激素类药物会产生不良反应。大蒜是目前已知的富含硫化物的天然药食兼用植物，由大蒜衍生的含硫化合物在哺乳动物细胞中有重要的生物化学和生理学作用，如细胞信号调节、细胞抗氧化系统[24]、抗炎作用[25]和调节机体免疫系统[26]。本实验研究结果提示，大蒜及其含硫化合物可作为天然的硫化氢供体，可用于AR等气道急慢性炎症性疾病的治疗或预防。