产后逐瘀胶囊治疗产后出血的机制研究

唐连敏，付翠芳，宁 超，郝俊兰，姚莉芸 (河北省邢台市第三医院产科，邢台 054000)

产后出血是伴随产妇生产的常见多发现象，多指分娩后24 h内出血量>500 mL，病情严重者会因短时间失血过多诱发失血性休克症状，危及产妇生命[1]。据统计，我国每年约有70%的产妇在产后恢复过程中存在恶露不绝的现象[2]，虽不会危及生命，但长期流血淋漓不尽会导致产褥期缩复不良，影响产妇的身心健康和正常生活。产后恶露不绝的主要诱因包括宫缩乏力、凝血功能异常和术后感染等[3]，因此其对应治疗应以促进子宫收缩、止血补血和消炎抗炎为主，以加速内膜修复、缩短出血时间。

本研究利用一系列分子实验检测产后逐瘀胶囊对产后出血大鼠模型的血清生化指标、组织生理特性以及标记基因的表达变化影响，阐明并探讨产后逐瘀胶囊治疗产后出血的作用机制，为其临床应用提供相应理论支持。

1 仪器与材料

1.1仪器 RM6240E/EC型多道生理信号采集处理系统(成都仪器厂)；1-14K型小型台式冷冻离心机(Sigma公司)；BS200S型电子天平(赛多利斯集团)；Light Cycler®Nano荧光定量PCR仪(罗氏制药有限公司)；Biosens SC 950型凝胶成像系统(上海山富科学仪器有限公司)；NanoDrop 2000超微量分光光度计 (赛默飞世尔科技有限公司)；Glomax 96型微孔板型荧光检测仪/酶标仪(普洛麦格公司)。

1.2试药 产后逐瘀胶囊(规格：0.3 g×36粒，江西民济药业有限公司)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6 (IL-6)酶联免疫检测试剂盒，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6×)(批号P0015F)和放射免疫沉淀检测(RIPA)裂解液(批号P0013B)，均购自上海碧云天生物技术有限公司；大鼠免疫球蛋白A(IgA)和大鼠免疫球蛋白G (IgG)酶联免疫检测试剂盒，均购自武汉基因美生物科技有限公司；SYBR Green I Master (罗氏制药有限公司,编号04707516001)；反转录试剂盒(普洛麦格公司，批号A3500)；化学发光显色底物(赛默飞世尔科技有限公司，批号A38554)；RNAiso Plus提取液(Takara生物公司，批号Cat#9108)；磷酸化热休克蛋白27(P-HSP 27)鼠源抗体(批号sc-81498)和HRP-山羊抗鼠抗体(批号sc-200)，均购自圣克鲁斯生物技术有限公司；血管内皮生长因子(VEGF)鼠源抗体(艾博抗贸易有限公司，批号ab1316)；洛氏液，自制；异丙醇(上海沪试化工有限公司,批号40064360)；焦碳酸二乙酯处理水(DEPC，北京索莱宝科技有限公司，批号R1600)。

2 方法

2.1实验动物建模与分组 8～10周龄SPF级SD大鼠，以雌雄2∶1的比例合笼饲养(不包含空白组)，待阴栓出现后将雌鼠每只分笼饲养直至雌鼠生产。将产后大鼠随机分为造模组、产后逐瘀胶囊高、中、低剂量组，每组6只。处理组按组别在大鼠产后当天开始分别灌胃不同剂量的产后逐瘀胶囊颗粒物(用温开水冲服)，低、中、高剂量组分别按100，200，400 mg·kg-1灌胃。空白组和造模组在相同时间点灌胃等体积温开水。饲养条件：温度为20～25 ℃，日温差不超过3 ℃，光照时间为12 h，空气相对湿度保持在40%～70%之间。实验过程严格遵守实验室动物使用原则。

2.2样本采集 灌胃给药3 d后，观察到造模组和产后逐瘀胶囊高剂量组的出血情况存在显著差异，对各组大鼠麻醉后进行腹主动脉采血，用于后续血清生化因子测定，之后采用颈椎脱臼处死大鼠，立即解剖，取大鼠子宫，置于洛氏液中，剥离附着于子宫的结缔组织和脂肪组织，切取中段子宫平滑肌肌条，长约1 cm，宽约0.4 cm，厚约0.2 cm，用于后续判断子宫收缩能力。同时切取若干子宫组织块，快速置于液氮中以备后续蛋白提取和RNA提取测定相关基因表达变化。

2.3样本制备和检测方法 离体子宫平滑肌收缩活力测定方法：将收集的各组子宫平滑肌条一端固定在装有洛氏液的玻璃浴槽中，一端与张力换能器相连，负荷设置为1 g，以每秒1～2个小气泡通过氧气和二氧化碳混合气体(体积比为95∶5)，待子宫稳定收缩后，利用RM6240 E/EC多道生理信号采集处理系统对子宫收缩状况进行记录。记录离体子宫平滑肌条的收缩幅度、收缩频率以及收缩活动力，本试验重复6次。Elisa法检测生化指标因子：全血取样后在4 ℃以3 000 r·min-1离心10 min，得到血清后分装于提前预冷的离心管中，于-80 ℃保存，后续按照Elisa试剂盒说明书检测血清中各种生化指标因子以及免疫球蛋白的含量。包括TNF-α、IL-1、IL-6、IgA 和 IgG。RNA的提取以及反转录：取子宫组织约100 mg放入用液氮预冷充分的研钵充分研磨成粉末状后，加入RNAiso Plus 溶液1 mL，混合匀浆至透明后转移至离心管中，室温静置5 min，4 ℃离心吸取上清液,加入1/5体积氯仿，剧烈振荡15 s，乳化后在室温下静置5 min，4 ℃离心15 min，吸取上层透明水相至新的离心管中，加入等体积异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温静置10 min，4 ℃离心得到底部沉淀，用体积分数为75%的乙醇洗涤沉淀，离心后去除上清，室温晾干至RNA半透明，加入DEPC水溶解。使用超微量分光光度计测定RNA浓度，按照Promega反转录试剂盒说明反转录得到第一链cDNA用于后续qRT-PCR分析。待调查的基因包括基质金属蛋白酶7 (MMP7)、基质金属蛋白酶9 (MMP9)、基质金属蛋白酶抑制物-1 (TIMP-1)、三磷酸鸟苷酶A (RhoA)、三磷酸鸟苷酶激酶Ⅰ (ROCK Ⅰ) 及内参基因β-actin[4]。对应特异性引物序列如下：MMP7-F：GGTGTGGAGTGCCAGATGTT；MMP7-R：ACCATCCGTCCAGTACTCAT；MMP9-F：CTGGTGCTCCTGGCTCTAG，MMP9-R:GGCAAGTCTTCGGTGTAGC；TIMP-1-F:ACAGCTTTCTGCAACTCGGA，TIMP-1-R：AGCGTCGAATCCTTTGAGCA;RhoA-F：GTTTATGTGCCCACGGTGTT，RhoA-R:ACTATCAGGGCTGTCGATGG；ROCK Ⅰ-F:TGTGAAGCCTGACAACATGC，ROCK Ⅰ-R：CTGACCACCAGTCACACTCT;β-actin-F:TCTTCCAGCCTTCCTTCCTG，β-actin-R：CACACAGAGTACTTGCGATC。蛋白提取和Western-Blot分析：取子宫组织100 mg，置于液氮预冷研钵中研磨充分后转移至离心管中，加入RIPA裂解液，混合均匀后置于冰上裂解反应30 min，4 ℃离心10 min后得到上清液，即为蛋白样品，使用2，2-联喹啉-4，4-二甲酸二钠(BCA)法定量蛋白，调整至各组浓度一致后进行后续Western Blot分析。蛋白样品加入1/5体积SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，95 ℃加热5 min后迅速置于冰上，得到变性蛋白样品，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后以湿转膜法进行转膜(180 mA，90 min)，经封闭后，依次孵育一抗(1∶1 000)和二抗(1∶10 000)后进行化学发光显影，使用荧光图像分析仪获取蛋白印迹结果，比较各组子宫组织中P-HSP27和VEGF水平。

3 结果

3.1子宫平滑肌收缩实验 造模组大鼠经历分娩活动，其子宫平滑肌收缩幅度、频率以及收缩活动力显著高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；产后逐瘀胶囊低剂量组与造模组比较差异无统计学意义(P>0.05)，产后逐瘀胶囊中、高剂量组显著高于造模组以及低剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 产后逐瘀胶囊对大鼠离体子宫平滑肌的影响

3.2大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IgA和IgG的含量 造模组大鼠血清内促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6、IgA 和 IgG含量显著高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，尤其是IL-6提升了将近3倍，产后逐瘀胶囊低、中、高剂量组均可显著降低造模组中大鼠的相应蛋白含量，差异有统计学意义(P<0.05)，但降低后仍高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 产后逐瘀胶囊对大鼠血清中TNF-α、IL-1、IL-6、IgA 和 IgG含量的影响

3.3大鼠子宫组织中TIMP-1、MMP7、MMP9、RhoA以及ROCK Ⅰ的表达 造模组大鼠子宫组织中MMP7的表达水平与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)，产后逐瘀胶囊低、中、高剂量组相比于造模组可降低MMP7和MMP9的表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)，且呈剂量依赖性；造模组大鼠TIMP-1含量显著低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，产后逐瘀胶囊处理组可显著提升TIMP-1含量，差异有统计学意义(P<0.05)；造模组大鼠子宫组织中RhoA和ROCK Ⅰ的表达水平高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，低于产后逐瘀胶囊中、高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)，与低剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

3.4大鼠子宫组织中VEGF和P-HSP27蛋白表达 造模组大鼠子宫组织中VEGF和P-HSP27含量均高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，P-HSP27低于产后逐瘀胶囊低、中、高剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 产后逐瘀胶囊对大鼠子宫组织TIMP-1、MMP7、MMP9、RhoA和ROCK Ⅰ表达的影响

表4 产后逐瘀胶囊对大鼠子宫组织VEGF和P-HSP27蛋白含量的影响

4 讨论

产妇因生产耗费气力多表现为气虚血瘀、脉络不畅，需益气扶正、祛邪化瘀[5]。此时产妇气虚不固，因此需用平衡之法，否则便有伤正之忧。因此此时机体免疫应答不宜过强，否则引发过强炎症反应伤累机体，但也不宜过弱，否则无法抵抗外界感染。免疫球蛋白是机体免疫应答中的重要组分，其可通过促进T淋巴细胞活化，增强巨噬细胞吞噬能力和机体免疫力[6]。本研究发现，产后逐瘀胶囊可显著降低造模组中IgA和IgG含量，同时又保持高于空白组，降低机体损伤所引发的过强的免疫应答，同时又提高免疫力保障机体稳步修复。

MMP9和MMP7在适度水平下可加快胶原分解过程[7-8]，利于子宫陈旧组织蜕落，但促炎因子会促进子宫内膜部位基质金属蛋白酶(MMPs)的合成异常升高，进而破坏MMPs/基质金属蛋白酶抑制物(MMPs/TIMPs)的平衡，造成血管基底膜降解，诱发血管通透性增加，破坏血管完整性，造成炎性细胞浸润，增加潜在的出血可能[9]。子宫内膜基质降解还会引发间质水肿造成内膜表面溃疡等炎性反应，影响子宫内膜的修复，延长出血时间[10]。本研究发现造模组相比于空白组中MMPs以及促炎因子TNF-α[11]、IL-1[12]和IL-6[13]显著上调，揭示产后恢复过程引发了强烈的炎性反应，产后逐瘀胶囊高、中、低剂量组相比于造模组中促炎因子显著下调，与上文免疫球蛋白含量变化相一致。同时TIMP-1含量显著上升，且MMPs也呈现剂量依赖性的下降趋势，说明产后逐瘀胶囊可以通过降低炎性反应改善MMPs/TIMPs平衡，进而缩短产后恶露持续时间。

VEGF可特异性诱导血管生成[14]，本研究中造模组VEGF含量显著高于空白组，说明在子宫恢复过程中对于新生血管的需求较高，但有研究显示，其过度表达会诱发血管增生，引起子宫异常出血[15]。本研究发现，产后逐瘀胶囊可降低造模组异常高表达的VEGF，但又高于空白组，进而介导正常平衡的产后新生血管重塑，促进子宫内膜的修复。同时，VEGF还具有激活神经再生的功能[16]，因此产后逐瘀胶囊亦可通过提升VEGF的水平起到镇痛和抗惊厥的作用。

产后宫缩乏力也是造成产后子宫复旧不全引发恶露不绝的重要原因，造模组虽然相比于空白组具有较高的子宫平滑肌收缩能力，但这是由于分娩活动造成的；造模组虽然与产后逐瘀胶囊低剂量组在子宫收缩能力上无显著差异，但产后逐瘀胶囊中、高剂量组的子宫收缩能力显著高于造模组，说明产后逐瘀胶囊可以兴奋子宫，具有行血去瘀的功效。中医学认为：瘀血不去，新血不生；瘀血不去，新血不得归经；离经之血妄行，瘀滞胞中，血海不宁而致崩漏之症。产后出血不止实则气滞血瘀之症，去瘀生新才是治疗此症的关键所在。相比于造模组，产后逐瘀胶囊处理组子宫组织中RhoA和ROCK Ⅰ的表达水平明显上调，揭示产后逐瘀胶囊的有效成分可通过激活RhoA/磷酸鸟苷酶(RhoA/Rho)信号通路参与产后子宫收缩调节，加速排血过程[17]。热休克蛋白27(HSP27)是一种在平滑肌组织表达丰富的小分子热休克蛋白，被报道其参与肌动蛋白丝骨架重塑[18]，其P-HSP27可介导肌肉收缩[19-20]。经Western-Blot检测分析发现，产后逐瘀胶囊可显著提升子宫组织中P-HSP27的含量，从而增进子宫平滑肌收缩能力，减少因宫缩乏力诱发的产后出血以及子宫复旧不全。

综上所述，产后逐瘀胶囊可舒缓产后激增的强免疫应答，维持机体炎症反应处于合理范围，从而保障子宫内膜基质代谢正常运作，修复内膜血管，降低出血，同时，产后逐瘀胶囊可促进RhoA/Rho信号通路介导子宫平滑肌加强收缩，从而达到治疗产后出血恶露不绝的目的。