盐酸戊乙奎醚对脑梗死模型大鼠的神经保护作用及机制▲

唐晓怡 谭红保 赵 倩 李玉芳 吴 荻

(湖南省长沙市第四医院麻醉科，长沙市 410000，电子邮箱：tdw489@163.com)

脑梗死主要由脑组织局部供血不足引起，脑组织缺血缺氧性坏死、神经功能障碍是其典型的表现[1-2]。中老年人群为脑梗死高发群体，男性发病率相对较高，随着我国人口老龄化现象加重，每年新增脑梗死病例数不断上升，引起广大专家学者的关注[3-4]。盐酸戊乙奎醚是一种广谱的抗胆碱药物，能够拮抗M1受体，减轻神经元损伤[5-6]，将其应用于脑血管疾病，鲜有研究报告。本研究通过建立脑梗死大鼠模型，使用盐酸戊乙奎醚进行干预，观察其治疗效果，旨在探究盐酸戊乙奎醚对脑梗死模型大鼠的神经保护作用及相关机制,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 30只健康雄性SD大鼠，由吉林大学动物实验中心提供[使用许可证号：SYXK(吉)2020-0004)]，鼠龄7～9(8.1±0.7)个月，体重227～252(239.6±9.8)g。在相对湿度50%～55%、温度21℃～25℃的环境中适应性喂养1周，光照12 h/d。主要试剂：盐酸戊乙奎醚(成都力思特制药股份有限公司，批准文号：H20051948)；过氧化氢酶(catalase，CAT)、活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-1β酶联免疫吸附检测试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司(批号：HZ-E14940；SZ-HAS-285；EK-M29386；EK-R36902、EK-R36877)；兔抗大鼠Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)抗体(HyClone公司，批号：A26388、A25267)；小鼠抗兔Beclin-1、微管相关蛋白1轻链3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3β，MAP1LC3B)抗体(Dako公司，批号：D7751,D8652)；大鼠抗小鼠磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)抗体(Gibco公司，批号：A1973、A2768)；山羊抗兔IgG(艾美捷科技有限公司，批号：H20190201)； TTC溶液(青岛海博生物技术有限公司，批号：20200501)；4%多聚甲醛(上海歌凡生物科技有限公司，批号：20200731)；Western封闭液、Western洗涤液(上海威奥生物科技有限公司，批号：20200331；20200402)；酶标分析仪(上海酶联生物科技有限公司，型号：ML-dr3518)。

1.2 建模及分组干预 将大鼠按照随机数字法分为正常组、模型组和盐酸戊乙奎醚组各10只。给予所有大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg进行麻醉后固定于实验台，消毒颈部，将颈部正中部位皮肤剪开，显微镜下将颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉分离暴露于术野，正常组随后缝合伤口，作为假手术对照。于其他大鼠近心端结扎近端颈外动脉，微动脉夹夹住颈内动脉，结扎固定颈总动脉，阻断大鼠脑组织中动脉，取下微动脉夹，根部固定颈内动脉，再次进行消毒处理后缝合伤口。建模过程中模型组大鼠死亡1只。建模成功24 h后正常组、模型组大鼠腹腔注射1 mL生理盐水，盐酸戊乙奎醚组大鼠腹腔注射盐酸戊乙奎醚，剂量为2 mg/kg，溶于1 mL生理盐水后腹腔注射。所有大鼠均连续干预7 d，1次/d。

1.3 指标检测

1.3.1 学习记忆能力、神经行为学评估：(1)自各组大鼠干预6 h后，对学习记忆能力进行评估。准备高50 cm、直径150 cm圆形水池，水池中央有一高30 cm、直径10 cm平台，水池口标记4个位点作为大鼠入水口(四点相连为正方形)，注入半池水，水温27℃。分别于已4个位点将大鼠置入水中，记录大鼠自入水点游至预置平台时间，将120 s内未游至平台的大鼠引至平台，记为120 s。大鼠在平台上停留30 s之后，测试其他入水口，计算4个入口大鼠游至平台的时间平均值，即大鼠平均逃避潜伏期时间，每天1次，所有大鼠均连续测试5 d。逃避潜伏期时间越长，大鼠学习记忆能力越差。(2)对各组大鼠神经行为学指标进行评价[7]。其中0分为行为学正常无障碍；1分为左前肢伸展异常；2分为向一侧旋转；3分为向一侧倾倒；4分为丧失自主活动能力，意识障碍。

1.3.2 脑组织含水量和梗死体积检测、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色：(1)含水量测定。干预7 d后，各组大鼠分别取5只，腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg进行麻醉后颈椎脱臼法处死，取大鼠脑组织，使用滤纸吸取大鼠脑组织表面水分，称重得到脑组织的湿质量，将脑组织置于95℃烤箱中烤至恒重，称取干质量，计算含水量，脑含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。(2)梗死体积测定。对各组剩余大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg进行麻醉后颈椎脱臼法处死，取模型组、盐酸戊乙奎醚组大鼠缺血区脑组织及正常组大鼠脑组织，-30℃冰箱冷冻保存0.5 h，取出脑组织制作厚约10 μm的连续切片。每间隔3片取1片，置于-80℃冰箱保存备用。取各组脑组织切片,37℃环境中使用2% TTC溶液染色0.5 h，使用4%多聚甲醛固定6 h，拍照，使用经病理图像分析系统测定梗死面积，并以此对脑组织梗死体积进行测算。(3)HE染色。取1.3.2(2)中各组大鼠脑组织切片，将切片烤干后进行脱蜡处理，之后顺序置入不同浓度的酒精中脱水3 min。使用苏木精染色15 min后清洗3次，使用盐酸酒精分化处理30 s，充分清洗之后使用1%伊红染色，使用酒精进行脱水处理后进行脱蜡处理，封片后使用显微镜对各组大鼠脑组织细胞病理状况进行观察。

1.3.3 脑组织氧化应激指标、炎症指标水平检测：取1.3.2(2)中各组大鼠脑组织切片，采用酶联免疫吸附实验法检测氧化应激反应指标CAT、ROS、8-OHdG及炎症因子IL-6、IL-1β水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.4 TLR4/NF-κB通路蛋白、自噬和凋亡相关蛋白表达量检测：免疫印迹法检测脑组织中TLR4、NF-κB，自噬相关蛋白Beclin-1、MAP1LC3B，以及凋亡相关蛋白PI3K、mTOR的相对表达量，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参。提取50 μg蛋白，煮沸5 min使蛋白变性后用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后依据蛋白分子大小把凝胶切开并转移至聚偏二氟乙烯膜上,用Western封闭液在室温下将待测蛋白和内参蛋白封闭90 min,按1 ∶1 000稀释待测蛋白抗体，内参抗体以1 ∶2 000比例稀释,孵育过夜4℃，使用Western洗涤液洗涤5次，每10 min 1次。加入稀释山羊抗兔IgG(1 ∶5 000),孵育60 min，室温水平摇床,洗涤5次Western洗涤液,每10 min 1次。经过ECL显色和曝光后，使用Bio-Rad成像系统进行成像，使用Image J图像分析系统检测条带的灰度值,以目标蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为目标蛋白的相对表达量。

1.4 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计数资料以例数和百分比表示，比较采用χ2检验；正态分布的计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑组织病理学变化 正常组大鼠脑组织细胞排列整齐，结构完好，细胞核清晰，无病理变化。模型组大鼠脑组织细胞排列无规则，细胞核破裂，间质水肿，炎性细胞浸润情况严重。盐酸戊乙奎醚组大鼠脑组织细胞排列较规则，细胞肿胀、破裂以及炎性细胞浸润的情况较轻。见图1。

正常组 模型组 盐酸戊乙奎醚组

2.2 各组大鼠的学习记忆能力和神经行为学评分 随着训练时间的延长，各组大鼠逃避潜伏期逐渐缩短(均P<0.05)。与正常组比较，模型组、盐酸戊乙奎醚组大鼠各时间点逃避潜伏期较长，神经行为学评分较高(均P<0.05)；与模型组比较，盐酸戊乙奎醚组大鼠逃避潜伏期较短，神经行为学评分较低(均P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠学习记忆能力和神经行为学评分的比较(x±s)

2.3 各组大鼠的脑组织梗死体积和含水量 盐酸戊乙奎醚组大鼠脑组织梗死体积小于模型组(P<0.05)。与正常组比较，模型组、盐酸戊乙奎醚组大鼠脑组织含水量较高(均P<0.05)；与模型组比较，盐酸戊乙奎醚组大鼠脑组织含水量较低(P<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠脑组织梗死体积和含水量的比较(x±s,%)

2.4 各组大鼠脑组织的氧化应激指标水平 与正常组比较，模型组、盐酸戊乙奎醚组大鼠CAT水平较低，ROS、8-OHdG水平较高(均P<0.05)；与模型组比较，盐酸戊乙奎醚组大鼠CAT水平较高，ROS、8-OHdG水平较低(均P<0.05)。见表3。

表3 3组大鼠脑组织氧化应激指标水平的比较(x±s)

2.5 各组大鼠脑组织中的TLR4/NF-κB通路蛋白表达量及炎症因子水平 与正常组比较，模型组、盐酸戊乙奎醚组大鼠TLR4、NF-κB蛋白相对表达量及IL-6、IL-1β水平较高(均P<0.05)；与模型组比较，盐酸戊乙奎醚组大鼠TLR4、NF-κB蛋白相对表达量及IL-6、IL-1β水平较低(均P<0.05)。见表4、图2。

表4 3组大鼠脑组织中TLR4/NF-κB通路蛋白相对表达量及炎症因子水平的比较(x±s)

图2 各组TLR4/NF-κB通路蛋白的表达情况

2.6 各组大鼠脑组织中的自噬和凋亡相关蛋白表达 与正常组比较，模型组、盐酸戊乙奎醚组大鼠Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR相对表达量较高(均P<0.05)；与模型组比较，盐酸戊乙奎醚组大鼠Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR相对表达量较低(均P<0.05)。见表5和图3。

表5 3组大鼠自噬和凋亡相关蛋白相对表达量的比较(x±s)

A B C

3 讨 论

脑梗死是一种临床常见的脑组织缺血缺氧坏死性疾病，具有病情进展快、致残致死率高的特点，严重威胁患者健康[8-9]。临床上治疗脑梗死的手段主要包括介入治疗、溶栓治疗等，但是目前尚无治疗脑梗死的特效手段，多数患者会出现一定程度的神经系统后遗症，因此寻找一种有效的治疗方法具有重要意义[10-11]。盐酸戊乙奎醚作为一种M受体拮抗剂，可选择性拮抗M1、M3受体，能够抑制乙酰胆碱毒性，从而减轻神经细胞损伤，具有一定的神经元保护作用。

脑水肿是脑梗死常见的病理改变，可损害神经系统功能。本研究中，模型组大鼠脑组织出现大片梗死病灶，镜下可见脑组织细胞排列无规则，细胞核破裂，间质水肿，脑组织含水量增加，符合脑梗死的病理改变。有研究显示，脑梗死的发生和发展不仅可造成机体神经功能的损害，还会对患者的认知功能造成一定的影响[12-13]。本研究结果显示，与正常大鼠相比，脑梗死大鼠的逃避潜伏期较延长，神经行为学评分升高(P<0.05)，提示脑梗死大鼠出现认知功能障碍和神经功能损害。而使用盐酸戊乙奎醚干预后，脑梗死大鼠的脑梗死体积减小，脑组织含水量下降，逃避潜伏期缩短，神经行为学评分降低(P<0.05)，说明盐酸戊乙奎醚具有一定神经保护作用，不仅可缩小脑梗死大鼠的梗死灶、减轻脑水肿，还可改善大鼠的神经功能和认知功能。

大量临床研究表示，脑梗死的发生和发展伴随着脑组织氧化应激损伤[14-15]。CAT是机体防御系统的重要酶类清除剂，能够清除过氧化氢，减轻细胞损伤。脑梗死的发生和发展过程中有ROS大量生成，致使脑组织神经元损伤，而ROS具有一定氧化性，故氧化产物8-OHdG也随之大量生成。本研究结果显示，脑梗死大鼠CAT水平较低，ROS、8-OHdG水平较高，而使用盐酸戊乙奎醚干预后脑梗死大鼠CAT水平升高，ROS、8-OHdG水平降低，说明盐酸戊乙奎醚干预能够减轻脑梗死大鼠脑组织氧化应激反应，从而发挥脑保护作用。

脑梗死的严重程度与炎症反应水平有着密切联系[16-17]。TLR4/NF-κB通路与机体炎症反应相关[18-19]：TLR4在脑组织血管细胞中表达，当脑组织出现血氧不足时，脑血管通透性增加，TLR4释放至血液中，从而参与炎症反应。IL-6、IL-1β为TLR4/NF-κB通路下游炎症因子，也与机体炎症反应密切相关。本研究结果显示，脑梗死大鼠脑组织TLR4、NF-κB蛋白相对表达量及IL-6、IL-1β水平较高，使用盐酸戊乙奎醚干预后脑梗死大鼠TLR4/NF-κB通路蛋白及下游炎症因子表达水平下调，说明使用盐酸戊乙奎醚干预能够抑制脑梗死大鼠脑组织炎症反应，从而起到脑保护作用。

此外，脑梗死的发生和发展还伴随着脑组织神经细胞自噬、凋亡[20-21]。Beclin-1、MAP1LC3B是评价细胞自噬情况的常用指标，二者表达变化与细胞自噬密切相关。PI3K、mTOR为PI3K/蛋白激酶B信号通路的相关蛋白，二者表达变化与细胞凋亡能力密切相关[22]。本研究结果显示，脑梗死大鼠脑组织Beclin-1、MAP1LC3B、PI3K、mTOR蛋白的表达量均较高，而使用盐酸戊乙奎醚干预的脑梗死大鼠上述蛋白的表达量降低，说明盐酸戊乙奎醚干预能够调控细胞自噬相关蛋白Beclin-1、MAP1LC3B及细胞相关凋亡蛋白PI3K、mTOR的表达，从而抑制脑组织神经细胞自噬、凋亡，进而发挥神经保护作用。

综上所述，盐酸戊乙奎醚不仅可缩小脑梗死大鼠的脑梗死体积、减轻脑水肿，还可改善大鼠的神经功能和认知功能。该药物的神经保护作用可能与其抑制氧化应激反应、调控TLR4/NF-κB通路及下游炎症因子以减轻脑组织炎症反应，以及调控相关蛋白以抑制神经细胞自噬和凋亡有关。