发酵马肉香肠菌种配比的优化及模糊数学评价

严宏孟，徐杨林，伊力夏提·艾热提，戴志伟，孔令明，周建中*

（新疆农业大学 食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052）

马肉是一种相比于牛、羊肉较低脂肪及胆固醇，而蛋白质含量以及不饱和脂肪酸含量相对较高的肉类[1-2]。食用马肉能够有效地促进血液循环、提高人体免疫能力，并且防止产生贫血等症状，堪称食补中的佳品[3]。因马肉中含有1%的糖原使得其具有一种独特风味[4]。正是因为上述特点，使得马肉逐步受到了大众消费者的欢迎。发酵香肠是指由动物瘦肉与脂肪经绞肉机绞碎后加入香辛料腌制，随后经过自然或人工添加发酵剂的条件下进行发酵，烘烤或煮至成熟[5-6]，具有特殊发酵风味[7]，良好的耐贮藏性的一类肉制品[8]。混合的发酵剂能够起到互补作用，既能产酸[9]，又能提高发酵香肠产品品质和安全性[10]。现如今市面上大多是以牛肉、羊肉、猪肉为原料制作的发酵香肠，品种单一，对以马肉为原料制作的发酵香肠研究甚少。

混料试验设计[11-13]是将若干不同成分的元素重新组成新物品，是一种受特殊条件约束的回归设计方法，只研究各个成分配制的比例，而与配制总量无关，相比于其他方法它能有效地减少试验次数，在数据处理计算以及分析过程中较为简易，同时具有快速得到最优配比结果等优势[14]。这种方法广泛应用于食品、工业、医药等方面[15]。安定等[16]研究利用了混料设计试验优化了发酵酸奶中复配稳定剂的配方，得到了相对稳定的产品。依据GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定标准》来进行感官评价，但其中不免有评定者自身主观因素，造成一定的非准确性[17]，基于此现象运用模糊数学法将一些模糊概念或难以量化的事物用数学的方式来进行精密的计算，可填补传统感官评价数据非定量化的漏洞[18]，从而实现对多因素影响产品感官的综合评价。本试验采用混料设计法，将马肉发酵香肠按照一定配比调料腌制，随后根据混料设计列表接种不同配比的菌种来进行混合发酵，试验以发酵产总酸含量以及用模糊数学法去评价马肉发酵香肠产品得出的分数作为指标对其进行综合的评估，通过软件分析得出产品风味最佳时菌种配比，为实现马肉发酵产品的深加工以及规模化生产提供了一定的理论和创新性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

马肉：新疆远航食品有限公司；食用盐、味精、胡椒粉、孜然粉、白砂糖、十三香、味精、姜粉、料酒：市售；亚硝酸钠（分析纯）：康迪斯化工（湖北）有限公司。

汉逊德巴利酵母菌（Debaryomyces hansenii）1808、木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylose）21445：中国工业微生物菌种保藏管理中心提供；瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus）B25、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）E11、保加利亚乳杆菌（Lactobacillusbulgaricus）：新疆农业大学微生物试验室保存。

亚硝酸钠、氯化钠、氢氧化钠（均为分析纯）：东莞市乔科化学有限公司；MRS培养基、麦芽汁培养基、营养肉汤（琼脂）培养基：北京奥博星生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

Binder KB系列生化培养箱：济南鑫晟生物技术有限公司；AVC-4D1超净工作台：河南兄弟仪器设备有限公司；GF29DA高压灭菌器：北京天赐科仪商贸有限公司；101-2电热恒温鼓风干燥箱：绍兴市景迈仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 马肉发酵香肠的工艺流程及操作要点

工艺流程：马肉预处理→接种与腌制→灌肠→浸洗→静置→发酵→烘烤→蒸煮→包装

基本配方：原料肉100 g，料酒0.5 g，白糖5 g，食盐2.2 g，孜然粉0.23 g，白胡椒粉0.1 g，五香粉0.2 g，十三香0.5 g，味精0.1 g，姜粉0.3 g，白胡椒粉0.1 g，孜然粉0.23 g，亚硝酸盐100 mg/L，大豆分离蛋白2 g。

操作要点：将原料马肉的瘦肉绞碎，脂肪切成1 cm3大小，按照肥瘦比2∶8进行均匀混合，加入白糖、食盐、香辛料腌制30 min，温度设为4 ℃，随后加入混合发酵剂与馅料充分接触混合，再在无菌状态下灌肠，肉与肠衣尽量贴紧，并用无菌水擦拭干净肠衣表面油脂和杂质，随后用无菌针扎孔排出多余的气体，30 ℃恒温培养箱发酵20 h，制备的香肠在65 ℃烘烤条件下2 h后终止发酵，随后在蒸煮锅中水烧开的条件下蒸煮20 min，将产品包装在真空压缩袋中。

1.3.2 乳酸菌菌种选择试验

将活化好的3株乳酸菌按照2%的接种量分别接种到未添加白糖、食盐、香辛料的纯马肉肉糜中（模拟马肉香肠发酵环境），在37 ℃恒温箱中培养18 h后加无菌蒸馏水稀释肉糜并搅拌过滤，将样品液体稀释涂布于固体培养基中培养，测定最终马肉肉糜的活菌数和总酸含量，结合两个指标最终选出1株发酵性能较好的菌株。

1.3.3 菌种拮抗试验

用接种环挑取3株菌株的单菌落，两两依次交叉划线于营养琼脂培养基平板上进行拮抗试验。试验的培养温度设为37 ℃，时间设定为15 h，待长出菌落后，观察三种菌株划线的交叉处是否生长菌落，假如试验菌落不能在两菌落交叉处生长，说明菌间有拮抗作用；假如试验菌能在两菌落交叉处生长则说明菌间无拮抗，可用于马肉香肠的发酵，为进一步试验打下基础。

1.3.4 菌种的耐盐驯化试验

参考赵强等[19]的方法略作改动，首先称取10 g马肉制备成无香辛料以及盐类的马肉香肠样品浸提液（全过程均在无菌环境下进行操作），将浸提液作为菌种生长的液体培养基，内部均加入质量浓度为100 mg/L的亚硝酸钠，随之添加不同梯度浓度（0%、1%、3%、5%）的NaCl，灭菌冷却备用。吸取对数生长期菌液以1%加入0%NaCl浓度的液体培养基中，在37 ℃的环境中培养24 h（酵母菌30 ℃、48 h）后进行菌落测定，菌落总数在108CFU/mL以上时，即可斜面保存，再次活化进行下一梯度的培养，并且培养直至总菌落数达到108CFU/mL为止，进行储存，为下一步试验做准备。

1.3.5 菌株混料设计试验

选取3株发酵性能较好的菌株，使用驯化试验培养至浓度不低于1×108CFU/mL的菌种接种于已添加白糖、食盐、香辛料的马肉馅料中，接种量为2%，灌肠后在发酵温度30 ℃条件下培养20 h，并以Design-Expert 12.0中Mixture的Simple centroid来进行试验设计，以产品发酵产生的总酸含量和模糊数学法得到的感官评分作为响应值，进行数据分析，得到最佳优化发酵菌种的配比。

1.3.6 建立模糊数学模型

试验以产品的色泽、气味、组织状态、滋味为因素集U=（色泽U1、气味U2、组织状态U3、滋味U4），以优、良、中、差为评语集V=（优V1，良V2，中V3，差V4）[20-21]，得分设计80～100分为优，60～80分为良，40～60分为中，20～40分为差。设置权重集为X={0.2，0.2，0.1，0.5}，其中分别代表颜色20分，气味20分，组织状态10分，滋味50分，合计100分。模糊关系评价集Y=XR（R为评价的次数除以k，k=10）。最后引入综合评分矩阵T来对评价Y进行处理，因感官评价具有一定差异性，所以取中间量，设置评价等级集K=｛k1=90，k2=70，k3=50，k4=30｝，最终得到马肉发酵香肠的模糊综合评价总分T=Y×K。

感官评定标准：随机选择10位食品专业研究生作为感官评分成员，按照GB/T 22210—2008《肉与肉制品感官评定标准》进行培训，小组成员要求对所有样品进行评分。感官评分标准见表1。

表1 发酵马肉香肠感官评定标准Table 1 Sensory evaluation standards of fermented horse meat sausage

续表

1.3.7 理化指标检测

活菌数测定：根据GB 4789.2—2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[22]，利用稀释涂布的菌落计数方法，将涂布后的培养皿置于37 ℃或30 ℃（依据不同菌种培养条件进行选择），培养24 h。

总酸测定：参考GB/T 12456—2008《食品中总酸测定》。

1.3.8 数据处理

运用IBM-SPSS 19和Design-Expert 21.0软件对试验数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 发酵乳酸菌菌种选择

三种不同乳酸菌在马肉香肠发酵过程中所产生的总酸含量和总活菌数如表2所示。由表2所知，三种乳酸菌发酵的总活菌数均能够达到108CFU/mL，总酸含量均＞6 g/kg。这是由于微生物在发酵过程中以马肉香肠中还原糖为繁殖生长的底物能够产出酸性物质。其中植物乳杆菌E11总活菌数以及总酸含量最高，分别为4.27×108CFU/mL、6.68 g/kg，均显著高于其他两种菌种（P＜0.05）。由于要选择优势菌种，能够充分的利用马肉中糖类物质进行发酵，得到优质的马肉产品，所以最终本试验所用乳酸菌为植物乳杆菌E11。

表2 不同乳酸菌发酵马肉香肠的总酸含量和总活菌数Table 2 Total acid content and total viable counts of fermented horse meat sausage with different lactic acid bacteria

2.2 拮抗试验结果

图1 菌种拮抗试验结果Fig.1 Experimental results of strain antagonism

如图1所示，汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445、植物乳杆菌E11两两划线交叉点处菌落生长繁殖状况良好，菌落间没有出现抑制两者周围菌落生长的情况，不存在拮抗作用。表明三种菌种彼此之间可在发酵过程中进行正常发酵，并发挥菌种自身优势，可发酵出品质更加优越的产品。

2.3 菌种的耐盐驯化试验结果

植物乳杆菌E11、汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445驯化结果见表3～表5。

表3 植物乳杆菌E11耐盐驯化试验结果Table 3 Domestication of Lactobacillus plantarum E11 salt tolerance

表4 木糖葡萄球菌21445耐盐驯化试验结果Table 4 Domestication of Staphylococcus xylose 21445 salt tolerance

表5 汉逊德巴利酵母菌1808耐盐驯化试验结果Table 5 Domestication of Debaryomyces hansenii 1808 salt tolerance

2.4 混料设计优化结果

本试验将A（汉逊德巴利酵母菌1808）、B（木糖葡萄球菌21445）和C（植物乳杆菌E11）3个因素设为自变量，以2%接种量接种至马肉肉馅中，灌肠发酵，30 ℃恒温培养条下发酵20h，将发酵后的总酸含量和感官评分作为响应值，运用Design-Expert 12.0软件中的Mixture的Simple centroid进行数据分析，混料设计试验方案及结果见表6，通过10名感官评价人员在相同实验条件下对16组马肉发酵香肠样品进行评价，得出的模糊数学感官评价结果见表7。

表6 不同菌种配比发酵马肉香肠优化试验设计及结果Table 6 Design and results of different strain ratio optimization tests for fermented horse meat sausage

表7 不同菌种配比发酵马肉香肠的感官评价结果Table 7 Sensory evaluation results of fermented horse meat sausage with different strain ratios

2.5 总酸含量和感官评分模型的建立及方差分析

此试验结果的二次多项回归拟合是通过Design-Expert 12软件得到的，对总酸含量（Y1）和感官评分（Y2）分别进行回归模型的建立，回归模型方程分别如下：

Y1=-0.844 9A+9.40B+5.95C+8.72AB+26.77AC+11.73BC

Y2=77.72A+52.52B+97.32C+54.45AB-15.95AC+43.25BC

总酸含量方差分析结果见表8。由表8可知，该试验模型具有显著性（P＜0.000 1），失拟项呈显著（P=0.000 5）。预测的R2值为0.937 5，这与调整后的R2值0.944 1大体上基本保持一致，能够说明此模型具有较好的拟合发酵马肉香肠总酸含量和菌种配比之间的关系。通过F值和P值可知，3个因素之间具有显著交互作用，对于总酸含量作用大小顺序依次为AC＞BC＞AB，代表A（汉逊德巴利酵母菌1808）、C（植物乳杆菌E11）两者交互作用对香肠的发酵产酸具有较大影响。其他两组组合之间交互作用次之。

表8 以总酸含量为响应值的方差分析结果Table 8 Results of variance analysis using total acid content as response value

感官评分方差分析结果见表9。由表9可知，该试验模型也同样具有显著性（P＜0.000 1），失拟项显著（P=0.002 7）。预测的R2值为0.961 4，这与调整后的R2值0.972 3基本保持一致，能够很好的说明此模型有较好拟合发酵马肉香肠感官评分和菌种配比间的关系。通过表格F值和P值可知，3个因素之间具有显著交互作用，对于感官评分数值影响大小的顺序依次为AB＞BC＞AC，代表A（1808汉逊德巴利酵母菌）、B（21445木糖葡萄球菌）两者交互作用对香肠的感官评分具有较大影响。其他两组组合之间交互作用次之。

表9 以模糊数学感官评分为响应值的方差分析结果Table 9 Results of variance analysis using fuzzy mathematics sensory score as response value

2.6 总酸含量和活菌数模型交互项的响应曲面图分析

图2 汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445、植物乳杆菌E11交互作用对产品总酸含量（A）、模糊数学感官评分（B）影响的响应曲面及等高线Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between Debaryomyces hansenii 1808, Staphylococcus xylose 21445 and Lactobacillus plantarum E11 on total content (A) and fuzzy mathematics sensory score (B) of products

混料试验中，三元的等高线和响应面曲线图能够较为直观的体现出各因素在一定条件下的变化趋势和两两因素之间的交互作用对响应值总酸含量、感官评分的影响。3个因素交互作用对总酸含量、模糊数学感官评分的影响见图2，响应面呈曲面图说明三株菌落之间具有交互作用，其中C（植物乳杆菌E11）对于总酸含量变化影响最大，当其水平为0.75时，总酸量达到最大10.66 g/kg，而A（汉逊德巴利酵母菌1808）、B（木糖葡萄球菌21445）对总酸量也有较为显著的影响。C（植物乳杆菌E11）同样对感官评分影响作用也最大，当数值达到0.5时，感官评分值为最高（88分），说明该水平酸味程度是可以被接受的，同时香肠整体综合评价也较高，其他两种菌对其影响程度较弱。

2.7 发酵剂配比优化及验证试验

运用软件最优化功能来进行菌种配比优化试验以及验证试验，并设定所需最高响应值，运行软件后，在给定因素范围内随机组合若干组菌种配比并预测数值，最终不断趋近于理想响应值，如表10所示，根据试验实际情况以及是否易于操作等因素选出汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445与植物乳杆菌E11以0.75∶0.75∶0.50配比组合，该试验条件下，总酸含量、感官评分分别为10.57 g/kg、88.039分，为证明软件预测结果的可行性，此组合进行3次重复试验进行验证，平均总酸含量为10 g/kg，平均感官评分为88.05分，二者良好的拟合性说明了模型预测可行性，结果并无明显差异，说明此软件进行的菌种配比优化具有现实性意义。

表10 各菌种最佳组合及预测结果Table 10 Optimal combinations of various strains and prediction results

3 结论

本试验以总活菌数和总酸量为指标，通过菌种选择试验确定了发酵乳酸菌菌种为植物乳杆菌E11，并将其与汉逊德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445交叉划线，三种菌种间无拮抗作用，运用模糊数学法得到不同配比菌种发酵香肠的感官评分，利用软件混料设计优化菌种配比，最终选择菌种最优配比为汉逊德巴利酵母菌1808∶木糖葡萄球菌21445∶植物乳杆菌E11=0.75∶0.75∶0.50（V/V）。马肉产品在此菌种配比水平时平均总酸含量为10 g/kg，平均感官评分为88.05分。肠体表面呈明亮枣红色，具有纯正浓郁的发酵气味及酸味，切面肉馅紧实，界面清晰，能够适宜广大消费者口味，具有普遍接受性，混合发酵剂的应用也为马肉发酵产品的开发提供新的理论支撑。