基于ITS2和psbA-trnH序列的药用甘草分子鉴定

崔秀婷，刘 俊，耿雅萍，田欣涓，刘亚令

（1.山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801；2.中国药科大学药学院，江苏南京 211198）

甘草属（Glycyrrhiza Linn.），属于豆科蝶形花亚科，为多年生草本或半灌木，世界范围内约有20 种，大部分分布在欧亚大陆，且集中分布在亚洲中部。其中，我国有8 种，主要分布于黄河流域以北的省区，在云南西北部发现了个别种[1]。药材甘草为豆科植物乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）或胀果甘草（Glycyrrhiza inflata Batalin）的甘草根及根茎[2]。药用甘草中含有多种活性成分，具有抗氧化、抗炎、调节免疫力、抗溃疡、解毒、抗肝纤维化等药理作用，可与多种中药配伍，药效平缓，多起调和药性的作用。目前，已从中分离出300 余种黄酮类成分，20 余种三萜皂苷类成分及多糖成分[3]，杨瑞等[4]对市售药用甘草成分的含量测定表明，不同基原甘草的药效有明显不同，在临床应用中应区别对待。但在实际市场上，由于中药材甘草根部形态十分相似，采用传统方法对中药形状、颜色、气味等进行鉴定，存在着较大的主观性和经验性[5]，不能达到较好的鉴定效果。要准确鉴别药用甘草品种，需要从多个方面进行，比较繁琐复杂[6]。因此，探寻一种准确、有效、快速的鉴定方法十分必要。

DNA 条形码（DNA barcoding）由加拿大分类学家HEBERT 等提出[7]，是利用基因组中一段标准短序列来进行物种鉴定，具有准确快速、重复性和稳定性高的优点，是近年来基于分子标记技术发展起来的一种物种鉴定新技术。DNA 条形码技术与传统鉴定方法相比，是基于物种基因型的差异鉴定，且仅需少量组织材料即可实现物种鉴定，是传统鉴定方法的有效补充[5]。众多研究者对适合作为植物的DNA barcoding 进行了积极的探索，对ITS2、matK、psbKpsbI、rbcL、rpoB、rpoC1、psbA-trnH、rps4、trnL-trnF 和atpF-atpH 等条形码进行了研究[8]。其中，rbcL＋matK在生命条形码国际联盟植物工作组的建议下被作为核心条形码，随后生命条形码联盟植物工作组在第三届国际DNA 条形码会议上建议将叶绿体psbA-trnH 片段和核基因片段ITS 作为补充条形码[9]。

随着DNA 分子条形码的发展，ITS、ITS2、psbAtrnH、matK 与rbcL 等相继对甘草属植物尝试鉴别，得出利用ITS2 序列和psbA-trnH 序列2 种DNA条形码鉴定甘草属植物效果最好[10-11]。陈士林等[12]建议选用ITS2 和psbA-trnH 序列为植物类药材的核心条形码，同时建立了中药材DNA 条形码鉴定体系，其良好的鉴定能力也已得到众多研究者的认可[13-16]。由于目前对甘草属杂交区亲本和杂交类群形态分化没有明确的分类依据和认识，在实际应用时易把杂交种当成亲本种，造成药用甘草资源应用和研究的混乱，种源不清，质量无保障等问题[17]。

本试验以ITS2 为主，psbA-trnH 为辅对同域分布的药用甘草物种从分子水平上进行种类鉴别，旨在为药用甘草新品种选育提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验收集了乌拉尔甘草（ura-N）、胀果甘草（inf-A）、光果甘草（gla-A）、胀果光果杂种甘草（G-A）4 类甘草种共20 个样本硅胶干燥叶片，其中，乌拉尔甘草样本5 个，采集于新疆尼勒古县；胀果甘草、光果甘草以及胀果光果杂种甘草样本分别5 个，采集于新疆阿拉尔。4 类甘草种样本的形态略有不同，乌拉尔甘草复叶长1.50～4.10 cm，叶缘稍皱或平坦，小叶数2～8 片；胀果甘草复叶长1.50～4.10 cm，叶缘皱，小叶数3～7 片；光果甘草复叶长4.25～12.40 cm，叶缘平滑，小叶数9～15 片；胀果光果杂种甘草复叶长5.50～12.00 cm，叶缘微皱，小叶数5～11 片。

1.2 试验方法

1.2.1 总DNA 提取 本试验采用改良的CTAB 法[18]提取样本DNA。取0.020 0 g 干燥叶样在液氮中研磨成粉末，将其置于1.5 mL 离心管中，加入预热至65 ℃的CTAB 提取缓冲液1 mL、β－巯基乙醇1 μL，混匀，放入65 ℃水浴锅中水浴1 h，期间需上下颠倒3～4 次。水浴后冷却至室温，10 000 r/min 离心7 min，取上清液并加入等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提，颠倒数次，12 000 r/min离心5 min；再次取上清液加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1）抽提，颠倒数次，12 000 r/min 离心10 min；取上清液加入2.5 倍体积无水乙醇，倒置数次，置-20 ℃冷冻30 min，8 000 r/min 离心5 min，挑出的絮状沉淀，用70%的酒精清洗2 次，室温晾干至无酒精味。用50 μL 的TE 溶解，即为DNA 模板。

1.2.2 PCR 扩增及测序 根据《中药材DNA 条形码分子鉴定指导原则》[12]进行ITS2 序列和psbA-trnH序列的扩增。PCR 反应体系和扩增程序[19]如表1 所示。取5 μL 的PCR 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，恒压100 V，30 min 左右，用紫外凝胶成像仪观察并切割目标条带进行测序（由上海生工生物工程股份有限公司完成）。

1.3 数据分析

测序后的序列经CExpress 软件序列拼接、校对，导入到DNAMAN 软件中获取多序列比对图；在MEGA 7.0 软件上进行全局比对，比对后的序列统计GC 含量，同时采用Kimura 2-parameter（K2P）计算遗传距离，并基于邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育树，NJ 树各分支的置信度用boot-strap text 作1 000 次可信度分析。

表1 PCR 反应体系和扩增程序

2 结果与分析

2.1 PCR 扩增产物检测

通过CTAB 法对所有药用甘草样本进行DNA提取，利用超微量核算蛋白测定仪对样本DNA 质量进行检测，得各样本DNA 的A260/A280值范围为1.64～2.05，符合DNA 纯度质量标准，可用于后续试验。利用1%琼脂糖凝胶电泳进行PCR 扩增产物检测，结果显示，ITS2 序列扩增产物条带范围在400～500 bp（图1），psbA-trnH 序列扩增产物条带约500 bp（图2），目标片段均与预期相符。

2.2 ITS2 及psbA-trnH 序列变异分析

利用软件MEGA 7.0 对ITS2 及psbA-trnH 序列进行碱基信息统计，结果显示，ITS2 序列保守位点有217个，变异位点为6 个，变异率为2.69%，简约信息位点有3 个；psbA-trnH 序列保守位点有216 个，变异位点184 个，变异率为43.60%，简约信息位点有59 个。

利用DNAMAN 对ITS2 和psbA-trnH 进行多序列比对，结果如图3 所示，4 类甘草属植物在ITS2序列16～18 bp 位点处，乌拉尔甘草样本多为TGC（除乌拉尔甘草3 号碱基变为CAC 外），胀果甘草、光果甘草及胀果光果杂种甘草在此处均为CAA；在30、89、102 bp 处胀果甘草9 号与其他胀果甘草样本相比均存在变异，分别为C-A、C-T、A-T；psbAtrnH 序列中，4 类甘草属植物变异位点较多（图4），在245～249、303～305 bp 均存在碱基缺失（圆圈），只有光果gla-A3 为CGTAC、TAC，在228～232 bp 位点处其他序列多为ATCAG，gla-A3 为TAATC（方框），在348～351 bp 处其余光果样本多为AAGT，而gla-A3 为ACAG（方框）；在胀果甘草和杂交种中，inf-A9 和G-A14 存在多个位点变异（短横线）。此外，在330 bp 位点处乌拉尔甘草和光果甘草碱基多为G，胀果甘草与胀果光果杂种甘草为A。

2.3 基于ITS2 及psbA-trnH 序列种内种间遗传距离分析

表2 甘草属各种间、种内遗传距离

由表2 可知，ITS2 序列中，乌拉尔甘草与光果、胀果、胀果光果杂种甘草的种间遗传距离分别是0.014 5、0.011 8、0.011 8，均大于种内遗传距离和其他种间遗传距离；胀果甘草与光果甘草、胀果光果杂种甘草的种间遗传距离均为0.002 7，显著小于种内遗传距离。psbA-trnH 序列中，胀果光果杂种甘草杂种与乌拉尔甘草、光果、胀果的种间遗传距离分别为0.110 1、0.111 0、0.110 8，且均小于种内遗传距离；胀果与乌拉尔甘草、光果的种间遗传距离为0.077 5、0.078 5，且均小于种内遗传距离。可能与inf-A9 和G-A14 的变异位点较多有关。

2.4 ITS2 及psbA-trnH 序列系统发育树分析

利用MEGA 7.0 软件对样本的ITS2 序列构建系统发育树，结果如图5 所示，系统发育树基本分为两大支，其中，乌拉尔甘草单独聚为一支；胀果甘草，光果甘草，光果胀果杂种甘草聚为另一支，说明ITS2 可将乌拉尔甘草与胀果甘草、光果甘草、光果胀果杂种甘草区分开来。

利用MEGA 7.0 软件对样本的psbA-trnH 序列构建系统发育树如6 所示，NJ 树基本分为2 个大支，其中，光果胀果杂种甘草与胀果甘草聚为一支；乌拉尔甘草与光果甘草聚为另一支。表明光果胀果杂种甘草的遗传背景偏向于胀果甘草，乌拉尔甘草与光果甘草的亲缘关系较近。

2.5 ITS2 及psbA-trnH 序列的GC 含量分析

通过MEGA 7.0 软件对药用甘草ITS2 和psbA-trnH 序列的GC 含量进行分析，结果如表3 所示，ITS2 序列长度均为223 bp，乌拉尔甘草的GC平均含量为53.36%，与光果甘草、胀果甘草及光果胀果杂种甘草的GC 含量差异分别为0.45、0.45、0.63 百分点。psbA-trnH 序列长度在384～407 bp，胀果光果杂种甘草与胀果甘草之间的GC 含量差异最大，为3.70 百分点，与乌拉尔甘草之间的GC含量差异次之，为3.61 百分点，与光果甘草之间差异为2.91 百分点。

表3 ITS2 和psbA-trnH 序列的GC 含量分析

3 结论与讨论

利用条形码序列ITS2 和psbA-trnH 进行物种鉴定是现代药用植物鉴定中的常用手段，袁俊杰等[20]利用种间K2P 距离和系统进化树对10 种苍耳属杂草的鉴定表明，ITS 和psbA-trnH 序列是鉴别苍耳属杂草较理想的条形码。赵海等[21]以psbA-trnH为主、ITS2 为辅，对黔太子参2 个人工选育品种黔太子参1 号和太子参丰抗1 号进行了明确鉴定。本试验利用ITS2 和psbA-trnH 序列对乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和胀果光果杂种甘草进行序列比对和系统发育树构建，在ITS2 序列16～18 bp 位点处乌拉尔甘草碱基为TGC，胀果甘草、光果甘草、胀果光果杂种甘草均为CAA，可将乌拉尔甘草与其他3 类甘草属植物区分开，这与郝杰等[10]基于ITS2序列的药用甘草亲缘关系鉴定研究的结果一致；psbA-trnH 在330 bp 处乌拉尔甘草和光果甘草碱基为G，胀果甘草与胀果光果杂种甘草在此位点处为A，可将胀果甘草与光果甘草分开，这与杨瑞等[4]利用ITS 和psbA-trnH 变异位点对不同基原甘草的分子鉴定及市售甘草药材的质量评价所得的结果相似。ITS2 序列16～18 bp 和psbA-trnH 序列330 bp 位点可以作为3 类已知甘草属物种的鉴别位点。而胀果甘草与胀果光果杂种甘草亲缘关系较近，需要补充其他序列进一步分析鉴定。

有研究发现，物种间的GC 含量差异可反映其亲缘关系的远近，蔡秀珍[22]利用ITS 序列中外类群海芋与内类群芋属植物的GC 含量相差不到1%，得出海芋属和芋属是2 个亲缘关系较近的类群。王丹等[23]通过ITS 序列中绿藻门植物TLD2A1 同其小球藻属的物种比对发现，二者之间GC 含量差异不足1.4%，得出二者亲缘关系较近。本试验通过对乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草及胀果光果杂种甘草ITS2 序列的GC 含量差异分析可知，乌拉尔甘草与其余材料的GC 含量差异最大，与遗传距离和系统发育树结果保持一致。但是psbA-trnH 序列的GC 含量差异分析显示，胀果甘草与光果甘草GC含量差异为0.79 百分点，说明二者之间亲缘关系较近，这可能与同域分布、自然居群中存在种间杂交基因渗透有关[24]。在psbA-trnH 序列中，光果胀果杂种甘草与光果甘草和胀果甘草之间的GC 含量差异分别为2.91、3.70 百分点，说明光果胀果杂种甘草与光果甘草的亲缘关系较近，而系统发育树中可见光果胀果杂种甘草与胀果甘草聚为一大支。出现此差异可能因为一是psbA-trnH 序列较其他叶绿体序列变异率较高，植物分化时叶绿体基因组中G、C 位点相对于A、T 位点更容易发生突变[25]；二是各物种分化后显著的生活环境差异影响（A＋T）/（G＋C）的值[26]；三是psbA-trnH 序列为叶绿体基因，遵循细胞质遗传，在世代杂交过程偏离孟德尔分离[27]，导致ITS2 和psbA-trnH 序列GC 含量分析结果出现差异。因此，序列的GC 含量与药用甘草的亲缘关系是否存在必然联系还有待进一步研究。

本试验利用ITS2 和psbA-trnH 对20 个药用甘草样本进行分子鉴定，通过分析各序列的碱基信息、变异位点、系统发育树及GC 含量，得出ITS2 序列长223 bp，可从中区分乌拉尔甘草；psbA-trnH 序列长度为384～407 bp，可进一步将光果甘草区分。表明以ITS2 序列为主、psbA-trnH 序列为辅的鉴定体系具有良好的鉴定能力，但此鉴定体系无法将胀果甘草与光果胀果杂种甘草区分开，更精准的鉴定仍需进一步试验研究。本试验研究结果结合传统形态学鉴定将为药用甘草的种类鉴定提供双重保障。