新型冠状病毒核衣壳蛋白生物信息学分析

王玉宁，解翠华，王胜男，范莹莹，江亚娟，尹强，焦伯延

（济宁市疾病预防控制中心 检验科，山东 济宁 272000）

0 引言

冠状病毒（Coronavirus）是广泛分布于自然界的一类正链RNA 病毒，现发现可感染人的有人冠状病毒229E（Human coronavirus 229E，HCoV-229E）、人冠状病 毒NL63（Human coronavirus NL63，HCoV-NL63）、人冠状病毒OC43（Human coronavirus OC43，HCoV-OC43）、人冠状病毒HKU1（Human coronavirus HKU1，HCoVHKU1）、严重急性呼吸综合征病毒(Severe acute respiratory syndrome coromavirus，SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)和严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)[1-3]。SARSCoV-2 爆发以来，严重威胁人民生命健康，是当前世界面临的最重要公共卫生问题之一[6]。

SARS-CoV-2 基因组全长约29.9x103bp[7]，含有12 个开放读码框（Open reading frame，ORF），其中N 基因开放读码框（Nucleocapsid Open reading frame，N-ORF）编码的N蛋白是SARS-CoV-2 的结构蛋白，N蛋白是一种具有高度免疫原性的磷蛋白，在病毒合成过程中，N蛋白直接结合基因组RNA 形成病毒核衣壳，并在SARS-CoV-2 复制、转录和组装过程中发挥关键作用[8-9]。此外，N-ORF 和N蛋白特异性抗体是SARS-CoV-2 病原学检测和抗体检测的重要依据[10-11]，N蛋白是疫苗和药物研发的重要靶点[9,11]。

目前对SARS-CoV-2 N蛋白的研究鲜有报道，N蛋白的功能暂不明了。本研究运用生物信息学方法预测N蛋白的进化变异特征、理化性质、结构、功能、抗原表位等信息，为更深刻的了解N蛋白的生物学特征和致病特征提供思路，为SARS-CoV-2 的预防、实验室诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 N蛋白序列获取

登陆NCBI 获取来源于人的新型冠状病毒N蛋白氨基酸序列（GenBank 号为MT432195.1）。

1.2 理化分析、亲疏水性分析和跨膜分析

利用ExPASy 的ProtParam 软件分析N蛋白的分子式、氨基酸组成等理化性质。利用ExPASy 的ProtScale 软件分析N蛋白的亲水性和疏水性；利用TMHMM 软件分析N蛋白的跨膜区域。

1.3 磷酸化位点分析和细胞定位预测

利用DisPhos 软件分析N蛋白的磷酸化位点；利用SignalP 软件分析N蛋白信号肽序列；利用cNLS软件分析N蛋白的核定位信号；PredictProtein 软件分析N蛋白的亚细胞定位。

1.4 结构预测

利用PredictProtein 软件分析N蛋白的二硫键形成；利用sopma 软件分析N蛋白的二级结构；利用Phyre2 软件预测N蛋白的三级结构。

1.5 抗原表位预测

利用NetMHCIIpan 3.2 Server 软件预测N蛋白的辅助性T 细胞抗原表位；利用NetCTL-1.2 Server 预测N蛋白的的杀伤性T 细胞抗原表位；利用ABCpred 软件预测N蛋白的B 细胞抗原表位。

1.6 蛋白、核酸结合位点预测

利用PredictProtein 软件预测N蛋白的DNA 结合位点、RNA 结合位点和蛋白结合位点。利用RPISeq 软件进行N蛋白与SARS-CoV-2 基因组结合预测。

2 结果

2.1 N蛋白进化分析

SARS-CoV-2 的N蛋白氨基酸序列与229E、NL63、OC43、HKU1，SARS，MERS-CoV 等可感染人的冠状病毒的N蛋白氨基酸序列MEGA 进化分析，发现新型冠状病毒N蛋白与SARS 冠状病毒N蛋白同源性最高，为90.52%。见图1。

图1 人冠状病毒N蛋白进化分析

2.2 N蛋白的理化性质

N蛋白由419 个氨基酸组成，共含6351 个原子，分子式为C1971H3137N607O627S7，相对分子量45625.70x103。419 个氨基酸中甘氨酸（Gly）、丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）、谷氨酰胺（Gln）、苏氨酸（Thr）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）含量较高，分别占氨基酸总数10.26%、8.83%、8.83%、8.35%、7.64%、7.40%、6.92%（表1）。带正电荷的精氨酸（Arg）和赖氨酸（Lys）共有60 个，带负电荷的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）共有36 个，等电点为10.07，不稳定系数为55.09，在哺乳动物网织红细胞体外半衰期为30h。

表1 N蛋白氨基酸组成情况

2.3 N蛋白亲水性、疏水性和跨膜结构预测

N蛋白的亲水性氨基酸占66.9%，第371 位的天冬氨酸亲水性最强；疏水性氨基酸占33.1%，第220和221 位的丙氨酸和亮氨酸疏水性最强；平均亲水系数是-0.97，结果表明N蛋白是亲水性蛋白质。见图2。此外，经TMHMM 软件对N蛋白跨膜结构进行分析，结果显示N蛋白无跨膜结构。

图2 N蛋白亲/疏水性分析

2.4 N蛋白磷酸化位点及亚细胞定位分析

N蛋白共含有37 个丝氨酸、32 个苏氨酸、11 个酪氨酸，其中苏氨酸和酪氨酸均不能被磷酸化，但是位于180、183、184、186、187、188、190、193、194、197、201、202、206 位的13 个丝氨酸可以被磷酸化。见图3。N蛋白无信号肽序列，含有两个核定位信号，分别是位于258-268 的PRQKRTATKAY 和位于370-379 的KDKKKKADET，主要分布于细胞核。

图3 N蛋白磷酸化位点分析

2.5 蛋白结构预测

N蛋白氨基酸序列中不含有半胱氨酸，无二硫键。N蛋白二级结构中α 螺旋占21.24%，延伸链占16.71%，β-转角占6.92%，无规卷曲占55.13%。见图4。利用Phyre2对N蛋白进行三级结构预测，模板序列是PDB 数据库SARS 冠状病毒d1sska 序列，可信度为100%。见图5。

图4 N蛋白的二级结构预测

图5 N蛋白三级结构模型预测

2.6 抗原表位预测

对N蛋白进行抗原表位预测，结果显示，N蛋白有6 个杀伤性T 细胞（Killer T cells，CTL）抗原识别表位，即：48-56、78-87、101-112、164-172、295-303、352-360 位氨基酸，其中104-112 位氨基酸抗原性最强。N蛋白有11个辅助性T细胞（HelperTcell，Th）抗原表位，即：52-60、64-72、111-119、130-140、157-165、171-179、227-235、268-278、331-338、360-368、392-400 位氨基酸，其中392-400位氨基酸抗原性最强。N蛋白含有10 个B 细胞抗原识别表位，即：12-39、58-74、77-106、114-151、182-197、249-264、268-283、289-304、327-342、354-391位氨基酸，其中91-106 位氨基酸抗原性最强。

2.7 结合位点预测

对N蛋白进行蛋白、DNA、RNA 结合位点预测，结果显示N蛋白第87 位氨基酸和107-111 位氨基酸是与其它蛋白相互作用的结合位点。N蛋白含有丰富的DNA结合位点，包括6-17、28-45、48-51、69-77、84-101、114-127、144-153、173-211、255-289位氨基酸。N蛋白的35-37、83-98、255-261 和272-277 位氨基酸是RNA 结合位点。见图6。因为N蛋白是病毒核衣壳蛋白，在病毒组装过程中结合基因组5’端RNA[12]，利用RPIseq软件预测N蛋白35-98 和255-277 位氨基酸均与SARS-CoV-2 基因5’端1-200核苷酸可以相互结合。

图6 N蛋白结合位点预测

3 结论

SARS-CoV-2 感染是目前全世界最关注的突发公共卫生事件，对世界的经济、交通、文化及人民的生命健康造成重大影响[13]。我国将SARS-CoV-2 感染列为乙类法定传染病，参照甲类管理[10]。然而SARSCoV-2 的生物学特征暂不明了，生物信息学分析N蛋白对于了解病毒的进化变异、防治、诊断具有重要意义。

SARS-CoV-2 和SARS 的N蛋白序列高度同源，SARS-CoV-2 和SARS 的N蛋白可能有共同祖先和共同特点[14]。SARS-CoV-2 的N蛋白含有66.9%的亲水性氨基酸，是无跨膜结构的亲水性蛋白质，其等电点高达10.07，说明N蛋白带有大量正电荷，这些正电荷可能参与基因组RNA 和宿主DNA 结合。N蛋白是SARS-CoV-2 的磷蛋白[15]，经预测含有13 个丝氨酸磷酸化位点，N蛋白的磷酸化可能改变N蛋白的结构与功能，可能为病毒的在人体内的生存、传播提供优势。

N蛋白含有丰富的Th、CTL 和B 细胞抗原识别表位，提示N蛋白可能引起宿主复杂的细胞免疫和体液免疫[9,16-17]。CTL 免疫能够引起宿主细胞的凋亡，参与肺炎的发生[18]。B 细胞产生的N蛋白特异性抗体是目前实验室血清学诊断的重要检测靶点[9,11]。91-106位氨基酸B 细胞抗原性最强，130-140、268-278、331-338 位氨基酸同时是Th 和B 细胞的抗原识别表位，这些氨基酸序列可能适合作为SARS-CoV-2 感染抗体检测的核心序列。

N蛋白含有两个基因组RNA 结合位点，N端RNA结合序列（N-terminal RNA-binding domain，NTD）和C 端RNA 结合序列（C-terminal dimerization domain，CTD)[15]。本研究对N蛋白的结合位点进行预测，35-98 和255-277 位氨基酸是N蛋白的RNA 结合区域，其可能与基因组RNA的5’端结合，参与病毒组装；此外，N蛋白还可能通过结合小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）、微RNA（microRNA，miRNA）和长非编 码RNA（Long noncoding RNAs，lncRNA）干扰宿主对SARS-CoV-2 抑制[19-20]，提示35-98 和255-277 位氨基酸区域可能作为抗病毒药物研究的靶点。此外，N蛋白含有丰富的DNA 结合位点，可能能够结合宿主基因组，干扰宿主细胞功能。

综上所述，本研究对SARS-CoV-2 的N蛋白的结构和功能进行生物信息学分析，对N蛋白的深刻了解具有重要意义，为新型冠状病毒的核酸检测和抗体检测提出建议，为抗病毒药物的研发提出新的思路。然而本研究仅是生物信息学预测结果，需要进一步的实验确证。