弹壳接触DNA的法医学研究进展

辛阳

中国刑事警察学院，辽宁 沈阳 110854

在涉枪类犯罪案件中，弹壳是重要的生物物证之一。20世纪中叶，随着技术手段的发展，法医DNA 实验室开始尝试对传统生物体液（如血液和唾液）以外的证据进行检测，包括与物体短暂接触后在客体表面留下的DNA，这类证据被称为“接触DNA”。与常规生物物证相比，接触DNA 具有微量的特点，DNA 含量常少于100 pg，属于低拷贝数（low copy number，LCN）模板[1]。弹壳DNA作为接触DNA的一种特殊形式，主要来源于裸手装弹及弹壳回收过程，然而，子弹击发产生瞬间高温高压气体以及子弹击发过程中产生的剧烈震动和射击残留物，使得弹壳上微量DNA 的有效提取和鉴定难度增大[2]。此外，在实际案件中，技术人员通常无法做到对弹壳接触DNA 的即刻采集和提取。研究发现，弹壳上残留的DNA 回收量随着采样时间的延长而逐步下降[3]，环境因素（湿度和温度）催化弹壳表面的氧化过程，加速了DNA的降解[4]。“混合”是弹壳接触DNA鉴定面临的另一挑战。MONTPETIT等[5]应用改良浸泡法对弹壳接触DNA 进行研究，发现约40%的子弹和弹壳样本在提高DNA 回收率的同时出现了DNA混合分型，其中97.4%的样本中包含装弹者的DNA，而2.6%的样本检测到非装弹者的未知来源DNA。另有研究[6]发现，无论装弹者是否刻意接触子弹，一旦击发后的弹壳被其他个体回收，DNA 混合分型中所包含的回收者的等位基因平均数均大于装弹者，这是因为相比于击发前，击发后弹壳表面遗留的接触DNA 不受高温高压气体等因素的影响，反而更易保留在弹壳上，该结果提示弹壳接触DNA 间接转移发生速度远比预料的快。而实际案例中犯罪团伙常多人合用枪支弹药，造成“二次接触”甚至“三次接触”的DNA混合，使弹壳接触DNA的检测变得更加复杂。总的来说，实际检案中所涉及的弹壳接触DNA常兼具法医物证疑难检材的微量、降解和混合三大问题。因此，规范采集、及时检测和预防污染是涉枪类案件中弹壳接触DNA成功提取的关键因素。

1 弹壳接触DNA检测的影响因素

1.1 个体细胞脱落差异及与枪弹接触方式

不同个体细胞脱落情况存在差异，因此，与弹壳接触后留下的DNA 量有较大不同。研究发现，从弹壳上提取到易脱落者的DNA 最高量约是难脱落者的50 倍[2]，总的来说，根据表皮粗糙程度，男性个体比女性个体普遍脱落更多的细胞或DNA[7]。除此之外，与枪弹的接触时间和力度也决定了弹壳接触DNA 的含量。有研究[8]认为，最后上弹的弹壳表面残留的DNA含量最高，这是由于在上弹过程中，所要求的装弹压力随着子弹数量的增加而增加，因此个体与子弹表面的摩擦力随之增大。吕晓革等[6]应用92 式手枪9 mm子弹，比较不同接触方式下击发前后弹壳接触DNA的分型效率，发现经过击发过程后，裸手装卸子弹非刻意接触组所遗留的DNA 分型有明显的位点丢失现象（n=10，P<0.001），而刻意接触组（接触时间长、力度大及涂抹唾液）位点丢失现象明显少于非刻意接触组，其中以涂抹唾液组的DNA 检出率最高。以上研究提示，人体细胞脱落差异和与枪弹接触方式直接决定了弹壳上接触DNA 的含量，是影响DNA 检出率的最主要因素。

1.2 弹壳和枪支的物理性质

弹壳接触DNA 的提取也受到子弹的材质、大小和枪支类型的影响。弹壳根据材质一般可分为铜壳、镍壳、钢壳镀铜、钢壳涂漆和非金属等，其中以黄铜弹壳最为常见。研究[9]发现，应用擦拭法、胶带粘取和真空超滤法采集的击发前后的镍弹壳接触DNA 含量远大于铜弹壳（未击发时P=0.000，击发后P=0.004）。CERVANTES-CERVANTES 等[10]认为，该现象来源于铜芯中铜离子催化还原反应导致氧自由基生成，促进了DNA 的氧化损伤和降解。而MORENO 等[11]研究发现，当使用螯合剂去除反应体系中的铜离子后，弹壳接触DNA扩增结果明显改善，说明铜离子主要是抑制PCR反应，而并非对DNA造成不可逆损伤。JANSSON等[2]通过对11 种枪支与弹药组合的研究，发现弹壳材料和枪支类型对弹壳接触DNA 含量有显著影响，当使用相同类型的枪支（来复枪和Zastava M57）时，涂漆弹壳（coated cartridge）的等位基因峰值高度比黄铜弹壳低6倍，而用猎枪发射的塑料霰弹接触DNA的含量最高，推测原因可能是在击发过程中，与金属外壳相比，塑料表面的温度较低。该研究表明，不同材质弹壳接触DNA 的提取率为塑料弹壳>镍弹壳>铜弹壳>涂漆弹壳。而使用的枪支类型对DNA回收率的影响甚至更高，同样的黄铜子弹，用手枪（如Zastava M70）射击时，弹壳接触DNA 的回收量约是冲锋枪射击时的15 倍，推测这可能是不同枪支击发时子弹瞬时加速度和枪管内温度的不同造成。目前，子弹大小与弹壳接触DNA 含量的关系尚无定论。但MILNTHORP等[12]研究发现，选择不同的DNA 收集方法，可提高不同规格子弹的DNA 回收率，其中胶带粘取法更适用于9 mm 子弹，但对于更大的子弹，应用浸泡法可回收更多的DNA。

1.3 子弹击发

既往研究发现，子弹击发过程可明显降低弹壳接触DNA的检出率。JANSSON 等[2]发现，从未发射的子弹（黄铜，9 mm 瑞典军用弹药m/39B）中提取的DNA量比用格洛克17 式手枪（Glock 17）击发后的子弹高10 倍。MONTPETIT 等[5]和THANAKIATKRAI 等[13]的研究证实，即使在极低外界温度下，击发子弹仍可造成可回收DNA 的量降低约30%，这可能是子弹击发瞬间产生高温造成了DNA分解或将DNA更紧密地黏附在子弹表面而不易提取。另外，火器发射后金属弹壳膨胀及半自动或自动火器弹壳的机械作用均可造成子弹和枪膛接触，这种击发压力也可能清除弹壳上的DNA。除此之外，也有研究[14]发现，击发后的弹壳接触DNA 出现大片段扩增不良，并伴随常规STR 试剂盒中易受PCR 抑制的牙釉蛋白基因（Amelogenin）扩增受阻，说明该DNA 分型失败也可能来自PCR 扩增过程受到抑制。目前，射击残留物是较明确的弹壳接触DNA 扩增抑制物之一[2]。射击残留物是指射击时通过弹膛和弹壳体间隙逸出并附着在弹壳体表面的枪弹底火药燃烧生成的烟垢、未完全燃烧的火药颗粒、微量金属屑及枪支润滑剂等，其主要成分包括未燃烧的火药，硝酸钾（KNO3）和硫酸钾（K2SO4）燃烧产生的金属氧化物及盐类，底火药燃烧产生的氯化钾（KCl）和三硫化二锑（Sb2S3），以及弹头摩擦产生的金属粉末等，这些物质对PCR 均有抑制作用[15]。郭磊等[16]应用双拭子法对子弹全部外表面和火药残留较少部分分别进行提取，发现后者基因型的检出率为24.44%，高于前者（16.67%），说明击发产生的射击残留物对弹壳接触DNA的鉴定有较大影响。

2 弹壳接触DNA的检验与鉴定

考虑到弹壳接触DNA 的鉴定常受到微量和PCR抑制物的影响，研究人员开始尝试对弹壳接触DNA的采集、提取、浓缩、纯化以及扩增等步骤进行改良，附表1 列出了近年来国内外弹壳接触DNA 鉴定相关的主要方法学研究[1，3，5，8，12-13，17-20]。然而，考虑到不同实验室所采用的DNA 提取方法和分析试剂盒存在差异，加之对弹壳接触DNA 鉴定成功的判定标准不同，故很难客观地比较不同方法的效率。综合各种方法，弹壳接触DNA鉴定的成功率为6%～26%[5，8]。

2.1 弹壳接触DNA的采集

擦拭法是目前采集接触DNA 常用的方法之一，包括一步擦拭法、两步擦拭法（包括第一步湿拭子+第二步干拭子和第一步湿拭子+第二步湿拭子）、裂解液擦拭法和微拭子擦拭法等[1]。瑞典国家法医中心（Swedish National Forensic Centre，SNFC）研究[2]发现，相比于传统棉签，植绒尼龙拭子有利于DNA 释放，从而获得更高的DNA 回收率。应用尼龙拭子擦拭结合Chelex-100 法提取，弹壳接触DNA 检出率得到明显改善，弹壳和子弹上的DNA（0.001 ng/μL）回收率分别从11.1%和16.0%提升至28.6%和43.3%。同时，有效的DNA 分型图谱数量也从5%增加到8%。DIELTJES 等[8]在传统擦拭法的基础上，采用浸泡和擦拭相结合的方法从证据样本中采集生物成分。即在Qiagen Buffer ATL 缓冲液中直接浸泡30 min 后进行擦拭，随后将拭子和浸出液于85 ℃孵育10 min，并在56 ℃下与蛋白酶K 共孵育1 h，随后使用PowerPlex®16 BIO、IdentifilerTM或MiniFilerTM试剂盒进行扩增。在2009—2013 年的涉枪类案件中，应用该方法分别在弹壳、枪弹和弹头获得7.1%、10.1%和29.5%的DNA分型成功率。随后，TROY等[17]对浸泡法进一步改良，在浸泡的同时加入超声降解法，与传统的双拭子法相比，该方法的DNA 回收率明显提升。为了最大程度地降低弹壳表面铜离子对DNA 检测的干扰，2015年，WAN 等[18]开发了胶带粘取法收集弹壳接触DNA。该方法与湿拭子擦拭法相比，可将暴露在DNA 溶液中的铜离子含量降至最低，同时也被证实是DNA 降解率最低的方法。该研究同时发现，与湿拭子擦拭法相比，胶带粘取法可从黄铜弹壳中获得更高的DNA 产量，但在镀镍枪弹上两种方法没有差异。另外，在最近的研究中，针对铜离子对弹壳接触DNA 鉴定的干扰，BILLE 等[3]在商品化漂洗溶液Qiagen Buffer ATL缓冲液中加入铜离子螯合剂胎牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）和三肽甘氨酸-甘氨酸-组氨酸（Gly-Gly-His，GGH）的混合液，使平均DNA 回收量从200 pg 提高至14 ng，并成功获得所有样本的DNA分型。与以水为溶剂的传统两步擦拭法相比，DNA平均降解指数（degradation index，DI）由1.9 降至1.0～1.4。同时，研究人员在该漂洗溶液的基础上进行浸润擦拭法改良，分别采用两轮4 次反复浸润配合海绵和棉签拭子擦拭收集。与两步擦拭法相比，该方法有效提升了DNA 回收量（从49 pg 提高至143 pg，P=0.000 9），并显著改善了GlobalFilerTM试剂盒各STR 位点的平均相对荧光单位（relative fluorescence unit，RFU；P=0.000 3），为铜弹壳表面接触DNA的采集提供了参考。相反，PRASAD 等[9]最近的研究结果表明，与传统擦拭法和胶带粘取法相比，近年新兴的真空过滤法对于击发前后的镍弹壳和铜弹壳接触DNA 采集没有显著优势，对于击发后的铜弹壳接触DNA 采集效率更是远低于传统擦拭法和胶带粘取法。由于该方法基于真空负压作用下洗脱液的瞬间抽离，推测可能在洗脱DNA 的同时也脱落了射击残留物从而干扰了后续DNA扩增反应。

2.2 弹壳接触DNA的提取和纯化

由于上述采集过程，特别是浸泡法常造成样本溶液体积大、DNA 纯度低且混有PCR 抑制物等问题，因此难以进行后续DNA扩增。目前，大多数研究使用传统有机溶剂法和硅基质法（Silica-based，主要包括硅珠和硅胶膜），多种基于硅珠和硅胶膜的商品化试剂盒已被开发，包括QIAamp DNA Mini 试剂盒、QIAamp DNA Investigator 试 剂盒、PrepFilerTMForensic DNA Extraction 试剂盒、EZ1 DNA Investigator 试剂盒以及DNA IQTMSystem 等。由于不同试剂盒所适用的分析过程和仪器不同，尚无法对以上方法的提取效率进行比较。HORSMAN-HALL 等[1]认为，使用有机溶剂法的DNA 提取效率远低于以DNA IQTMSystem 为基础的3 种改良方法。然而，MOTTAR 等[19]和RAY 等[21]研究发现，与使用QIAamp DNA Investigator 试剂盒相比，两步擦拭法（第一步裂解液润湿拭子+第二步干拭子）与有机溶剂纯化法协同提取获得最多与装弹者一致的DNA 分型。类似的，TROY 等[17]观察到有机溶剂法比使用EZ1 DNA Investigator试剂盒获得更高的DNA 产量，同时具有较高的RFU 和较好的峰高平衡。这种差异可能因为两实验分别采用了乙醇沉淀法和短片段（相对分子质量30 000）分子筛来进行DNA 溶液浓缩。DNA 扩增效果直接取决于加入扩增体系的模板量，VAN OORSCHOT 等[22]证实DNA 的提取步骤可导致约76%的DNA损失。因此，对全部DNA提取物进行浓缩后扩增是目前弹壳接触DNA 检验的另一种推荐方法。MONTPETIT 等[5]应用EZ1 DNA Investigator试剂盒对DNA提取物浓缩后扩增，分别在26%的擦拭样本和34.7%的浸泡样本中获得了成功分型，该结果相对于DIELTJES等[8]浸泡提取后加入最大体积的DNA 提取物（成功率为6.9%）具有显著提升。FAN 等[23]使用微透析浓缩法，将前一步得到的上清液应用微孔离心过滤装置Microcon® Centrifugal Filters洗涤浓缩，效果明显优于Chelex-100 法，该浓缩方法也被许多国内研究采纳。此外，也有研究对PCR直接扩增法进行了尝试。直接扩增法省去了DNA提取过程，比传统方法更经济快捷，灵敏度更高。THANAKIATKRAI 等[13]使用5 μL 0.1% TritonTMX-100 湿润弹壳配合植绒尼龙拭子进行两步擦拭法从铝弹壳中采集DNA，发现直接扩增法与标准的DNA提取 和DNA IQTMSystem 或Prep-n-GoTMBuffer 纯化的DNA 样本相比，提取成功率显著提升，其中应用GlobalFilerTM试剂盒和IdentiFilerTMPlus 试剂盒对样本直接扩增，可分别获得77%和90%的有效DNA 分型图谱，而经标准的DNA 提取方法的样本仅获得4%的DNA 分型图谱。采用直接扩增法、DNA IQTM提取法和预稀释法（磷酸盐缓冲溶液）对击发后的弹壳接触DNA 进行检测，分别获得了平均等位基因数11.1（7.9～13.9）、5.6（3.0～7.7）和2.3（0.2～4.0）。而从3种不同口径的枪支（Glock Model 19、AK47和Tavor T-21）的9 mm、7.62 mm 和5.56 mm 口径子弹获得的有效等位基因个数没有明显差异。除此之外，一些非标准提取和纯化方法也被证实能有效获得DNA分型，PRINZ等[20]应用质谱仪裂解缓冲液纯化DNA后，应用过滤捕获装置对样本进行浓缩，发现该DNA 提取方法适用于击发和未击发的弹壳STR 分析。该方法可获得与蛋白酶K DNA 纯化法相似的DNA 含量，同时也捕获了检测样本蛋白质成分的能力，在未来多组学的生物物证分析中具有更大潜力。

PRASAD等[24]的研究证实，使用Qiagen Buffer ATL组织裂解缓冲液浸泡方式进行DNA 提取并不影响击发后的9 mm 口径帕拉贝鲁姆手枪铜弹壳（9 mmP）和0.22 寸口径长来复枪镍弹壳（.22 Long Rifle，.22LR）的弹痕纹理细节，提示可以进行生物提取后的弹道比对。因此，当复杂枪击案现场存在两名以上持枪者或多名中弹者时，结合弹道学和微量物证学分析，弹壳接触DNA 鉴定亦可为犯罪现场重建提供参考。国内曾报道1 例根据弹壳接触DNA 判断子弹弹着点的案例[25]。现场对疑似弹着点进行棉线擦拭和Chelex-100 法提取DNA，Amicon® Ultra Centrifugal Filters 纯化扩增，分别在沙发腿2 处和东墙墙壁3 处获得与子弹击中两人一致的分型，并且根据子弹表面DNA 残留量在弹着点的下降规律判断弹着点先后顺序，弹壳接触DNA 鉴定凭借个体特异性优势完美弥补了微量物证的不足之处。

2.3 弹壳接触DNA的扩增和分型

弹壳接触DNA 扩增存在微量和抑制物等诸多不定因素，目前多数相关研究应用的是基于毛细管电泳检测的PCR 扩增试剂盒，如PowerPlex® 16 HS、Iden⁃tiFilerTMPlus、MiniFilerTM、GlobalFilerTM和PowerPlex®Fusion等，具有灵敏度更高和抗抑制性更强等特点[26]。考虑到微量降解问题，MiniFilerTM试剂盒被证实更适用于弹壳接触DNA的扩增。HORSMAN-HALL等[1]应用两步擦拭法对弹壳上的DNA 采集进行比较，发现尽管在常规装弹接触过程中，使用MiniFilerTM和Power⁃Plex® 16 BIO 试剂盒获得的有效等位基因之间差异无统计学意义，但当个体在上弹之前与弹壳刻意接触时，使用MiniFilerTM试剂盒的等位基因扩增成功率为22%，高于PowerPlex® 16 BIO 的7%，而所有样本经IdentifilerTM试剂盒扩增均未见有效分型。值得注意的是，MiniFilerTM试剂盒和PowerPlex® 16 BIO试剂盒扩增的样本中均存在一定比例的混合分型。MONTPETIT等[5]推荐50 pg 以上的DNA 样本使用IdentifilerTMPlus试剂盒，而低于50 pg使用MiniFilerTM试剂盒。随着测序技术的发展，也有学者尝试应用大规模并行测序（massively parallel sequencing，MPS）技术对弹药或弹壳中的低模板量线粒体DNA 进行检测。值得一提的是，HOLLAND 等[27]发现，在反应体系中加入螯合剂0.5 mol/L 乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）可以最大程度地提高产量，同时降低铜离子对扩增的干扰，提示在用于弹壳接触DNA 提取的浸泡溶液中加入EDTA有望提高回收率。

3 弹壳接触DNA检测的挑战和展望

目前，尽管弹壳接触DNA 的研究众多，但为了尽可能确定单一因素对DNA 提取效率和鉴定结果的影响，多数实验选择了单一个体刻意接触或唾液涂抹等方式模拟检材，甚至在预实验时对子弹表面进行了清理。同时，由于不同研究者对成功分型的定义存在差异，也使得多种DNA 提取和纯化方式的效率难以比较。值得注意的是，许多有效提取和纯化方法的统计学差异仅在未击发的子弹中观察到，这意味着在实际案例中，弹壳接触DNA 鉴定的成功率将远低于文献报道。另外，微量DNA 分型图谱常带来混合分型风险。PRASAD 等[9]根据澳大利亚悉尼地区STR 数据库常规分析标准（175 RFU）进行分析时，仅有3 例样本出现混合分型，而使用确认阈值（80 RFU）分析时，发现2 例擦拭样本、6 例胶带粘取样本、1 例真空抽滤样本和1 例PCR 直接扩增样本出现了drop-in 的混合分型现象。这提示我们，弹壳接触DNA 分型的分析在确定贡献者的数量以及随机变异、判断等位基因的drop-out和drop-in等方面面临挑战。目前，多种概率基因分型（probabilistic genotyping）方法（例如半连续和全连续）为混合弹壳接触DNA 样本的分析解释提供了更多效力，但实际案件中弹壳接触DNA 的混合分型，特别是低组分个体的基因分型，仍需结合其他物证和相关证据谨慎使用。