淫羊藿苷对胰腺癌细胞BxPC-3增殖和凋亡的影响与miR-9上调有关①

黄群莲 胡运春 陈永钧 代良敏 代良萍

(西南医科大学附属医院药学部，泸州 646000)

胰腺癌是一种诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤。在全世界范围内，胰腺癌的发病率和死亡率很高，中国胰腺癌的死亡率高达88%[1]。尽管近年来医学治疗上取得了非常大的进展，但胰腺癌的死亡率并未得到明显改善。一方面，其独特的解剖位置使该疾病难以诊断；另一方面，大多数患者对化学疗法产生抗药性[2]。因此，胰腺癌患者需要更有效、毒性更小的治疗方法。中药化合物已成为胰腺癌患者体内调节肿瘤免疫微环境的重要抗癌药物和辅助药物来源。淫羊藿苷是一种植物类黄酮苷，是中药材淫羊藿中有效的药理成分。淫羊藿苷因其雌激素样作用，对心脑血管系统、骨代谢、免疫和神经系统、性功能等具有广泛的药理作用，同时还发现其具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[3]。已有研究表明淫羊藿苷可通过抑制肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞的凋亡来抑制卵巢癌、肺癌、食管癌等多种癌症的发展，但其对胰腺癌的作用尚不清楚[4]。miRNA是一类长度为20～24核苷酸的小型非编码RNA，在细胞凋亡、代谢、细胞增殖以及分化等细胞中功能起关键作用。miR-9在乳腺癌、胃癌、肺癌等多种肿瘤中表达失调，发挥抑癌或致癌作用。已有研究表明，miR-9-5p在胰腺癌组织和细胞系中显著下调，这与胰腺癌患者生存时间较短有关[5]。因此，上调miR-9有望抑制胰腺癌的发展。本文利用体外培养的胰腺癌细胞来研究淫羊藿苷对胰腺癌细胞增殖和凋亡的作用及机制，为淫羊藿苷在临床上治疗胰腺癌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 淫羊藿苷(HPLC≥98%，成都博瑞特化学技术有限公司，货号：110583)；顺铂(浙江联硕生物科技有限公司，货号：PHR1624)；RPMI-1640培养基(上海慧颖生物科技有限公司，货号：C22400500BT)；胎牛血清、青霉素和链霉素双抗溶液(上海素尔生物科技有限公司，货号：16000-044、15140122)；四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂盒(上海信裕生物工程有限公司，货号：111105-500)；BCA试剂盒(上海易色医疗科技有限公司，货号：BC201)；活化的胱天蛋白3(cleaved caspase-3)抗体、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗体、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体(碧云天生物科技有限公司，货号：AC030-1、AB026、AB112、AF0003)；辣根过氧化物酶标记的二抗、Ki67和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体(上海艾博抗生物科技有限公司，货号：ab6728、ab15580、ab92552)；Lipofectamine 2000转染试剂(上海联硕生物科技有限公司，货号：11668-019)；miR-9 inhibitor质粒及各种引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成；SYBR-Green PCR试剂盒(苏州英弗基因科技有限公司，货号：INFG801-01)；cDNA逆转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，货号：BTN60906)。

1.1.2仪器 流式细胞仪购自美国BD公司；MuLTI SKAN GO 型全自动酶标仪购自上海智理科学仪器有限公司；K8500全自动凝胶成像系统购自南京世研仪器。

1.1.3细胞及培养 胰腺癌BxPC-3细胞购自美国典型培养物保藏中心，于RPMI1640培养基(含体积分数为10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素和100 μg/ml 的链霉素)，在体积分数为5% CO2条件下37℃恒温培养箱中培养。

1.2方法

1.2.1MTT法检测细胞活性 在96孔板中，将胰腺癌BxPC-3细胞分别用不同浓度淫羊藿苷(0、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L)处理24 h、48 h、72 h、96 h时，再用10 μl MTT染料处理细胞，然后与100 μl二甲基亚砜孵育15 min，用酶免疫分析仪在490 nm处测量光密度。用各浓度处理组细胞吸光值与 0 μmol/L 组细胞的光密度表示细胞活性。

1.2.2分组及处理 将BxPC-3细胞分为对照组、淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L组、顺铂10 μmol/L组、miR-9 inhibitor组、淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor组。对照组、淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L组BxPC-3细胞用终浓度含有Icariin 0、12.5、25、50 μmol/L 培养基培养；顺铂10 μmol/L组BxPC-3细胞用终浓度含有顺铂 10 μmol/L培养基培养；miR-9 inhibitor组和淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor组利用Lipofectamine 2000将100 nmol/L的miR-9 inhibitor质粒转染进入胰腺癌BxPC-3细胞后，用终浓度含有淫羊藿苷0或50 μmol/L培养基培养。

1.2.3克隆形成实验检测细胞生长 将胰腺癌BxPC-3细胞接种于6孔板(1×106个/孔)，继续培养14 d，其间每隔3 d进行换液并观察细胞状态，体积分数为4%多聚甲醛固定30 min，质量体积分数为0.25% 结晶紫染色20 min，计数菌落数量。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡 将胰腺癌BxPC-3细胞处理48 h后，胰酶消化胰腺癌BxPC-3细胞，12 000 r/min离心5 min，按1×106个/ml的浓度重悬胰腺癌BxPC-3细胞。在胰腺癌BxPC-3细胞悬液中加入5 μl FITC标记的膜联蛋白V和5 μl碘化丙啶，暗环境孵化15 min，然后通过流式细胞仪分析细胞凋亡情况。细胞凋亡率(%)=早期细胞凋亡率(%)+晚期细胞凋亡率(%)。

1.2.5蛋白印迹法检测Ki67、PCNA、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白相对表达水平 用RIPA裂解液提取各组胰腺癌BxPC-3细胞的总蛋白，并通过BCA试剂盒检测蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后，用半干转膜仪将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜，并在室温下，用脱脂牛奶封闭2 h。接着加入兔来源的单克隆一抗(Ki67 1∶1 000、PCNA 1∶1 000、cleaved caspase-3 1∶1 000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1 000)，在4℃封闭过夜。然后加入对应山羊抗兔单克隆二抗(1∶2 000)，室温封闭1 h。最后滴电化学发光液曝光，以GAPDH为内参，使用Quantity One软件分析目标蛋白质的相对表达水平。

1.2.6RT-qPCR检测miR-9 mRNA的表达 通过QIAzol裂解试剂提取1.2.2中各组胰腺癌BxPC-3细胞的总RNA，再通过cDNA逆转录试剂盒合成cDNA，并按照SYBR-Green PCR试剂盒说明书操作进行miR-9 mRNA测定。反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，用U6标准化。miR-9的上游引物序列：5′-GAGACATAGGTATCTTGTCCC-3′，miR-9的下游引物序列：5′-GCTTAGGACTAGGGACTCAACC-3′；U6的上游引物序列：5′-GTGGTCCGCGTAGCGAGT-3′，U6的下游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACAT-3′。

2 结果

2.1淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3细胞增殖 如图1所示：各不同浓度组胰腺癌BxPC-3细胞吸光值随时间变化逐渐出现差异，在24 h时，与0 μmol/L 组相比，50和100 μmol/L 组胰腺癌BxPC-3细胞吸光值明显减少(P<0.05)；在48 h时，与0 μmol/L组相比，25、50和100 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞吸光值明显减少(P<0.05，P<0.01)；在72 h时，与0 μmol/L组相比，12.5、25、50和100 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞吸光值明显减少(P<0.05，P<0.01)。选择淫羊藿苷12.5、25、50 μmol/L进行后续实验。

图1 MTT法检测不同浓度淫羊藿苷处理不同时间对胰腺癌BxPC-3细胞增殖的影响

如图2所示：与对照组相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L 组胰腺癌BxPC-3细胞克隆细胞数目及增殖标记蛋白PCNA和Ki67表达无明显变化，淫羊藿苷 25 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞克隆细胞数目减少(P<0.05)、增殖标记蛋白PCNA和Ki67表达下调(P<0.05)，淫羊藿苷 50 μmol/L和顺铂10 μmol/L 组克隆胰腺癌BxPC-3细胞数目显著减少(P<0.01)，增殖标记蛋白PCNA和Ki67表达显著下调(P<0.01)。

图2 不同浓度淫羊藿苷对胰腺癌BxPC-3细胞增殖的影响

2.2淫羊藿苷诱导胰腺癌BxPC-3细胞凋亡 如图3所示：与对照组相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞凋亡率及凋亡标记相关蛋白Bax、Bcl-2和Cleaved Caspase-3表达均无明显变化，淫羊藿苷 25 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞凋亡率及凋亡标记相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表达增加(P<0.05)、凋亡标记相关蛋白Bcl-2表达下调(P<0.05)，淫羊藿苷 50 μmol/L和顺铂10 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞凋亡率及凋亡标记相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表达显著增加(P<0.01)、凋亡标记相关蛋白Bcl-2表达显著下调(P<0.01)。

图3 不同浓度淫羊藿苷对胰腺癌BxPC-3细胞凋亡的影响

2.3淫羊藿苷上调胰腺癌BxPC-3细胞miR-9的表达 如图4A所示：与对照组相比，淫羊藿苷12.5 μmol/L 和顺铂 10 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞miR-9表达无明显变化，淫羊藿苷 25 μmol/L 组胰腺癌BxPC-3细胞miR-9表达上调(P<0.05)，淫羊藿苷50 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞miR-9表达明显上调(P<0.01)。如图4B所示：与对照组相比，淫羊藿苷 50 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞miR-9表达明显上调(P<0.01)，miR-9 inhibitor组胰腺癌BxPC-3细胞miR-9表达明显下调(P<0.01)；与miR-9 inhibitor组相比较，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor组胰腺癌BxPC-3细胞miR-9表达明显上调(P<0.01)。

图4 RT-qPCR检测不同浓度淫羊藿苷对miR-9 mRNA表达影响

2.4淫羊藿苷对胰腺癌BxPC-3细胞增殖抑制作用与miR-9上调有关 如图5所示：与对照组相比，淫羊藿苷 50 μmol/L组克隆胰腺癌BxPC-3细胞数目显著减少(P<0.01)、增殖标记蛋白PCNA和Ki67表达显著下调(P<0.01)，miR-9 inhibitor组克隆胰腺癌BxPC-3细胞数目显著增加(P<0.01)、增殖标记相关蛋白PCNA和Ki67表达显著上调(P<0.01)；与miR-9 inhibitor组相比较，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor组克隆胰腺癌BxPC-3细胞数目显著减少(P<0.01)、增殖标记相关蛋白PCNA和Ki67表达显著下调(P<0.01)。

图5 淫羊藿苷对胰腺癌BxPC-3细胞增殖抑制作用与miR-9上调有关

2.5淫羊藿苷对胰腺癌BxPC-3细胞凋亡诱导作用与miR-9上调有关 如图6所示：与对照组相比，淫羊藿苷 50 μmol/L组胰腺癌BxPC-3细胞凋亡率及凋亡标记相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表达显著增加(P<0.01)、凋亡标记相关蛋白Bcl-2表达显著下调(P<0.01)，miR-9 inhibitor组胰腺癌BxPC-3细胞凋亡率及凋亡标记相关蛋白Cleaved Caspase-3和Bax表达显著减少(P<0.01)、凋亡标记蛋白Bcl-2表达显著上调(P<0.01)；与miR-9 inhibitor组相比较，淫羊藿苷50 μmol/L+miR-9 inhibitor组胰腺癌BxPC-3细胞凋亡率及凋亡标记相关蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达显著增加(P<0.01)、凋亡标记相关蛋白Bcl-2表达显著下调(P<0.01)。

图6 淫羊藿苷对胰腺癌BxPC-3细胞凋亡诱导作用

3 讨论

胰腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，由于其表现较晚，症状不明确，缺乏有效的筛查手段，确诊时已经为晚期[6]。手术切除是胰腺癌的常用疗法，但是，只有大约20%的胰腺癌可以手术切除，其余的胰腺癌患者不得不依靠放射线和化学疗法，但是这些疗法产生的治疗效果小，存活率低[7]。胰腺癌预后很差，总体5年生存率只有5%～6%[8]。因此，急需开发治疗胰腺癌的新药物。淫羊藿苷是一种从中药材淫羊藿中提取的植物类黄酮苷，具有调节免疫、抗抑郁、改善心血管功能等多种药理活性。且已有众多研究表明，淫羊藿苷具有广泛的抗癌活性，可以有效地靶向癌症干细胞和耐药癌细胞，其作用机制包括细胞增殖凋亡及周期的调节、细胞侵袭迁移的调节、抗血管生成、抗转移和免疫调节等[9]。如，淫羊藿苷通过调节内质网应激介导的凋亡信号，对人食管癌细胞具有抗癌作用[10]；淫羊藿苷通过激活AKT/mTOR/ATG5途径抑制自噬，增强顺铂耐药卵巢癌细胞的化学敏感性[11]。本研究发现，淫羊藿苷呈剂量依赖性抑制胰腺癌BxPC-3细胞增殖，并诱导BxPC-3细胞凋亡。

肿瘤细胞具有增殖速度快并无限复制的特性，抑制肿瘤细胞的增殖能力可有效抑制肿瘤的发展。已有报道，淫羊藿苷可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活来抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖[12]。PCNA和Ki67是目前运用最为广泛的增殖标记蛋白，其表达量和细胞的增殖能力成正比[13]。本研究发现，淫羊藿苷减少胰腺癌BxPC-3细胞克隆细胞数目，下调增殖标记蛋白PCNA和Ki67表达。因此，淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3细胞增殖。在正常机体中，细胞增殖与凋亡是处于动态平衡的，而在肿瘤细胞中，细胞增殖与凋亡是失衡的[14]。凋亡是一种程序性细胞死亡的形式，具有复杂多样的潜在机制。当细胞受到物理刺激、药物或放射线刺激时，它们会通过受体将这些信号转移到细胞内环境中。恶性肿瘤通常表现出凋亡失调现象。已有研究表明，淫羊藿苷通过mTOR信号通路抑制卵巢癌SKVCR细胞自噬，并促进细胞凋亡[15]。本研究表明，淫羊藿苷增加胰腺癌BxPC-3细胞凋亡率及凋亡标记蛋白Bax和Cleaved Caspase-3表达，下调凋亡标记蛋白Bcl-2表达。Caspase-3是最关键的凋亡执行者[16]。Bcl-2可抑制细胞色素C的释放及caspase-3的激活，并可拮抗促凋亡基因Bax，抑制细胞的凋亡[17-18]。因此，淫羊藿苷诱导胰腺癌BxPC-3细胞凋亡。

众所周知，miRNA在细胞遗传学中起着重要的作用。在肿瘤发生和发展的过程，其与肿瘤细胞的增殖、凋亡、分化和转移有关。最近的研究报道，淫羊藿苷通过下调甲状腺癌细胞中miR-625-3p来抑制细胞增殖、迁移和侵袭[19]。已有研究报道，miR-9-5p在胰腺癌组织和细胞系中显著下调，过表达miR-9-5p可以显著抑制胰腺癌BxPC-3细胞的增殖和侵袭[20]。本研究发现，淫羊藿苷上调胰腺癌BxPC-3细胞miR-9的表达，抑制miR-9表达可逆转淫羊藿苷对胰腺癌BxPC-3细胞增殖和凋亡的作用。而阳性对照药物顺铂对胰腺癌BxPC-3细胞miR-9的表达并无影响。这说明虽然阳性对照药物顺铂与淫羊藿苷对胰腺癌BxPC-3细胞增殖和凋亡具有类似的作用效果，但是其作用机制却有所不同。淫羊藿苷可通过上调miR-9抑制胰腺癌BxPC-3细胞增殖，并诱导BxPC-3细胞凋亡。

综上所述，淫羊藿苷抑制胰腺癌BxPC-3细胞增殖，并诱导BxPC-3细胞凋亡，这与miR-9上调有关。本研究仅为体外细胞实验和机制的初步探讨，体内实验和更为详细的相关分子通路机制有待进一步研究。