大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立及验证

卞晓萍，刘 青，孔庆科，罗洪艳，李 沛

(西南大学 动物科技学院，重庆 北碚 400700)

目前广泛应用于大肠杆菌基因敲除的方法有噬菌体重组酶介导的λ-Red重组系统，该技术的原理是将一段携带有靶基因两侧各40～60 bp 同源序列的 PCR 产物或合成的寡核苷酸片段，通过电转化法导入宿主菌内，然后在Red重组酶的作用下，使导入宿主菌内的线性 DNA 片段与基因组上的特定靶序列进行高效的同源重组，从而将靶基因置换下来[1-2]。虽然λ-Red同源重组系统是细菌基因敲除的有力技术，但是通过FLP重组酶去除抗生素标记会在细菌的基因组上留下FRT疤痕[3]。在标准λ-Red同源重组系统中，每个转入的线性 DNA 片段均编码一个选择性的抗生素抗性标记，其两侧的FLP位点是 FRT疤痕的来源。如果使用该方法在同一个细菌中引入多个突变，则每次突变成功后遗留下的FRT疤痕都会影响下一个突变的成功率，比如：FLP重组酶可能会消除基因组上任意两个相邻的FRT位点，得到并非我们想要的突变；同时，过多的疤痕会使宿主菌的基因组变得不稳定，有可能发生基因组的重排[4]。本研究应用的无痕缺失方法与此相反，不会留下任何疤痕。除了λ-Red重组系统，自杀质粒介导的同源重组基因敲除方法也应用较为广泛，但该方法对某些保守且敲除困难的基因筛选效率极低，这也限制了该技术的应用。

在细菌和古细菌中发现的CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)与Cas蛋白共同作用可协助细菌抵御外源质粒、噬菌体等的侵害。其中，在嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)中发现的Ⅱ型 CRISPR/Cas9系统组分较为简单，操作较容易，是目前研究的热门工具，也是本研究所应用的CRISPR/Cas系统。CRISPR/Cas9系统需要转录两个RNA片段，一个是前体CRISPR(precursorCRISPR RNA，pre-crRNA)，另一个是转录激活 RNA(trans-activating RNA，tracrRNA)。这两个RNA通过碱基配对形成二聚体，与Cas9蛋白结合，形成复合物；然后，在pre-crRNA的介导下发挥Cas9蛋白的HNH与RuvC活性，切割基因组特定位置的DNA，形成DNA双链断裂[8]。JINEK等[9]将pre-crRNA和tracrRNA加工成一条单链RNA嵌合体，称之为gRNA。CRISPR/Cas9中gRNA的3′端还有一段小的前间区序列邻近基序( protospacer adjacent motifs，PAM)，目前证明PAM一般为NGG，是CRISPR/Cas9系统的必备区域。因为Cas9蛋白的切割作用不仅依靠crRNA序列与目标序列的碱基匹配，还要依靠与目标序列紧邻的PAM序列。若没有PAM序列或者该序列发生改变，那么Cas9蛋白就不能发挥作用，这也将限制CRISPR/Cas9系统的作用，使其不能应用在任意序列上，但是这种机制也使该系统能分清自身和外来的入侵者。基于CRISPR/Cas9这一优越的基因编辑工具，本研究以大肠杆菌W3310为背景菌株，建立大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统，对其waaL和wecA基因进行敲除，从而为大肠杆菌工程菌的构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒、培养基和抗生素E.coliTop10和E.coliW3110由本实验室保存。pCas9-CR4(#62655)、pKDsgRNA-p15(#62656)购自Addgene，其中，pKDsgRNA-p15是温敏型质粒；pKDsgRNA-Kan、pKDsgRNA-kan-DwaaL、pKDsgRNA-kan-DwecA由本研究构建，pSW3337-kan由本实验室保存。培养基为LB培养基。抗生素：氨苄青霉素(ampicillin)终质量浓度100 mg/L，卡那霉素(kanamycin)终质量浓度50 mg/L，氯霉素(chloramphenicol)终质量浓度25 mg/L，强力霉素(doxycycline)终质量浓度1 mg/L，阿拉伯糖终浓度0.2%。

1.2 主要试剂胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和琼脂粉购自英国 OXOID公司；氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、Tet启动子诱导剂强力霉素和阿拉伯糖购自生工生物工程(上海) 股份有限公司；Gibson assembly®master mix购自美国 NEB 公司；PrimerStar高保真酶购自大连宝生物公司；2×prime mix、DNA 产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒及Marker Ⅲ购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 PCR引物根据GenBank中公布的W3110菌株waaL和wecA的基因序列，用Snapgene软件设计引物(表1)，并送往生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

1.4 pKDsgRNA-kan-DwaaL质粒的构建原质粒pKDsgRNA-p15是壮观霉素抗性，为了后续的研究方便，将其换成卡那霉素抗性，并命名为pKDsgRNA-kan。通过网站http://crispor.tefor.net/crispor.py设计waaL基因的Spacer，然后将Spacer的20 bp序列加入引物gRNA-DwaaL-1F的5′端。以质粒pKDsgRNA-kan为模板，gRNA-DwaaL-1F和pair with F、pair with R和gRNA-DwaaL-2R为引物，使用PrimerStar高保真酶PCR扩增片段1和片段2。PCR产物经核酸凝胶电泳鉴定、回收后，用环形PCR法连接片段1和片段2[10]。获得的产物电转化至E.coliTop10感受态细胞中，小提质粒，用测序引物pKD_Seq5测序鉴定。将构建好的质粒命名为pKDsgRNA-kan-DwaaL。

1.5waaL基因同源修复供体DNA片段的扩增以E.coliW3110基因组为模板，DwaaL-1F和DwaaL-1R、DwaaL-2F和DwaaL-2R为引物，使用PrimerStar高保真酶PCR扩增片段3和片段4。PCR产物经核酸凝胶电泳鉴定、回收后，以DwaaL-1F和DwaaL-2R为引物，使用PrimerStar高保真酶将片段3和片段4用重叠延伸PCR法扩增同源修复供体DNA片段。

1.6 感受态细胞的制备及细菌的转化按照《分子生物学实验技术》中的方法制备E.coliW3110电转化感受态细胞。将pCas9-CR4质粒转化至该感受态细胞中，制备含有pCas9-CR4质粒的E.coliW3110电转化感受态细胞。将质粒pKDsgRNA-kan-DwaaL转化至感受态细胞中，最后制备同时含有pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan-DwaaL质粒的E.coliW3110电转化感受态细胞。本次制备感受态与前两次不同，感受态细胞在30℃生长至D600=0.8，然后加入终浓度0.2%的阿拉伯糖，继续培养30 min，以诱导重组酶基因的表达，最后再制备电转化感受态细胞[11]。将200～1 000 ng供体DNA加入到感受态细胞中，电转产物复苏后，稀释100倍，涂布于含卡那霉素、氯霉素以及强力霉素(1 mg/L)的LB平板上,30℃过夜培养，用引物DwaaL-1F和DwaaL-2R鉴定单克隆。

表1 引物序列

1.7 pKDsgRNA-kan-waaL质粒的消除将鉴定正确的突变株转接至LB液体培养基中，置于37℃过夜培养以消除pKDsgRNA-kan-DwaaL温敏质粒。图1为敲除模式示意图。

图1 CRISPR/Cas9系统敲除基因示意图[10]

1.8wecA基因的敲除为验证该系统能够有效地应用于大肠杆菌的基因敲除，用同样的方法将大肠杆菌W3110的wecA基因进行敲除。

1.9 pCas9-CR4质粒的消除由于pCas9-CR4质粒是p15a的复制子，而pKDsgRNA-kan质粒上的Spacer是针对p15a的复制子，因此将pKDsgRNA-kan质粒转入已敲除目的基因的宿主菌中，涂布于只含卡那霉素的LB琼脂平板上，置于30℃培养。挑取转化子检测其对氯霉素的抗性，若对氯霉素敏感，则已消除pCas9-CR4质粒。随后37℃过夜培养即可消除转入的pKDsgRNA-kan温敏质粒。

2 结果

2.1 pKDsgRNA-kan质粒的构建以pKDsgRNA-p15为模板，pKDsgRNA-2F和pKDsgRNA-2R为引物扩增pKDsgRNA载体DNA片段a；以pSW-3337-kan为模板，pKDsgRNA-1F-kan和pK-DsgRNA-1R为引物扩增卡那霉素基因 DNA片段b(图2)。将扩增产物经核酸凝胶电泳鉴定、回收后，用环式PCR法连接2个DNA片段，连接产物转化至E.coliTop10感受态细胞中。小提质粒，命名为pKDsgRNA-kan，并将其送至生工生物工程(上海) 股份有限公司测序，测序结果与预期序列一样，可用于下一步试验。

M.DNA Marker；1.DNA fragment a；2.DNA fragment b

2.2 pKDsgRNA-kan-waaL质粒的构建用PrimerStar高保真酶扩增片段1、片段2(图3)，产物经核酸凝胶电泳鉴定、回收后，用Gibson assembly®master mix组装，组装产物转化到E.coliTop10感受态细胞中，小提质粒，命名为pKDsgRNA-kan-waaL，并将其送至生工生物工程(上海) 股份有限公司测序，测序结果显示Spacer与gRNA序列与预期序列一样(图4)，可用于下一步试验。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 1；2.DNA fragment 2

图4 pKDsgRNA-kan-DwaaL质粒Spacer与gRNA测序图

2.3waaL基因同源修复供体DNA的扩增以提取的W3110基因组为模板，DwaaL-1F和DwaaL-1R为引物扩增DNA片段3，DwaaL-2F和DwaaL-2R为引物扩增DNA片段4，核酸凝胶电泳结果与预期条带大小均一致(图5)。回收上下同源臂，通过重叠延伸PCR法将上下同源臂融合，核酸凝胶电泳结果与预期条带大小均一致(图6)。

2.4waaL基因的敲除通过电转化法将供体DNA转入含pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan-DwaaL质粒的E.coliW3110，转化产物涂布于含氯霉素、卡那霉素以及强力霉素的LB琼脂平板。待平板上长出单克隆，用引物DwaaL-1F和DwaaL-2R对单克隆进行鉴定(图7)。waaL基因没有被敲除修复的菌，PCR显示约2 000 bp的条带，反之出现754 bp的条带。测序结果与设计的同源臂序列一致，表明敲除后的waaL基因在人工设计的供体序列下发生了同源修复。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 3；2.DNA fragment 4

M.DNA Marker；1.overlap DNA fragment

M.DNA Marker；1～6.PCR identification of waaL gene in W3110；7.Negative control；8.Positive control

2.5wecA基因的敲除为验证该系统能够确切地应用于大肠杆菌基因的敲除，对W3110的wecA基因进行敲除。构建pKDsgRNA-kan-DwecA质粒的DNA片段扩增结果如图8所示，该质粒测序结果如图9所示，同源修复供体DNA的扩增如图10所示。转化子鉴定如图11所示，测序结果与设计的同源臂序列一致，表明敲除后的wecA基因在人工设计的供体序列下发生了同源修复。以上结果均表明，本研究构建的CRISPR/Cas9系统在人工同源修复下，可对大肠杆菌基因进行高效敲除。

M.DNA Marker；1.DNA fragment 1；2.DNA fragment 2

图9 pKDsgRNA-kan-DwecA质粒测序图

3 讨论

虽然CRISPR/Cas系统最初是在细菌中发现的，但是大多数基于CRISPR/Cas系统的基因编辑则广泛应用于真核生物中[1,11]。与真核生物不同，细菌的非同源末端连接(non-homologous end-joining，NHEJ)修复能力比较弱，且在许多情况下，若无外源重组酶的协助，其同源定向修复(homology-directed repair，HDR)也不一定有效，因此CRISPR/Cas9系统诱导的基因组DNA双链断裂对细菌而言往往是致死性的。基于细菌的这一特点，研究者将CRISPR/Cas9系统与噬菌体重组酶介导的λ-Red重组系统相结合，使得供体DNA序列不需要克隆到载体上，可以直接转化DNA片段的PCR产物，从而提升CRISPR/Cas9诱导的同源修复效率，实现对大肠杆菌基因组更高效的编辑[12]。

M.DNA Marker；1.wecA gene homology repair DNA fragment 1；2.wecA gene homology repair DNA fragment 2；3.wecA gene homology repair DNA fragment fusion

M.DNA Marker；1～14.PCR identification of wecA gene in W3110；15.Positive control；16.Negative control

与以往应用于原核生物中的CRISPR/Cas9系统相比，本研究所用的CRISPR/Cas9无痕缺失系统无需使用任何选择性标记即可进行单步基因组改变，该系统含有靶向宿主细胞基因组的非温敏型pCas9-CR4和温敏型pKDsgRNA-kan两个质粒[11]。当运用该系统成功缺失一个基因后，若需继续缺失下一个基因，则可快速高效地消除温敏型pKDsgRNA-kan质粒；此时，由于宿主菌中仍含有非温敏型pCas9-CR4质粒，因此可直接用于下一个基因的缺失，无需再次转化pCas9-CR4质粒，这大大提高了试验效率。pCas9-CR4和pKDsgRNA-kan质粒都含有Tet调控表达系统，当无诱导药物(如强力霉素)存在时，TetR阻遏蛋白会与TetO操纵子结合，从而阻断Cas9蛋白和sgRNA的表达；当有诱导药物存在时，TetR阻遏蛋白的构象会发生改变，并从TetO操纵子上脱离下来，使得Cas9蛋白和sgRNA可以同时顺利表达，继而发挥CRISPR/Cas9系统的剪切基因组作用。为了更加严谨地调控表达Cas9蛋白，在Cas9蛋白相应序列的C末端添加了SsrA标签，SsrA标签可被ClpP蛋白酶识别；当Cas9蛋白“漏”表达时，由于SsrA标签的存在，ClpP蛋白酶可快速高效地降解Cas9蛋白，这使Cas9蛋白的调控表达更加严谨。该质粒还含有由阿拉伯糖诱导型启动子araCPBAD调控表达的Red 同源重组系统，以提高大肠杆菌同源重组效率。该系统与在真核生物中使用的CRISPR/Cas9系统情况不同，在大肠杆菌中，CRISPR/Cas9系统的主要作用不是用来“编辑”，而是用来筛选(负筛)；用来去除那些没有发生基于修复片段(供体DNA)同源重组的菌株，留下那些经同源重组修复后的突变株，其强大的负筛系统确保了较高的突变效率。JIANG等[13]也将CRISPR/Cas9系统与λ-Red 重组结合，与本试验应用的CRISPR/Cas9系统相比，本研究的2个质粒包含所需的所有组件，不需要额外的修饰，并且没有宿主特异性。除此之外，本研究所应用的方法在做单突变时，需要5 d，包括gRNA靶向所需的所有克隆步骤，这与其他基因敲除方法所需时间差不多。但是，在做多个突变时，由于宿主菌已经包含pCas9-CR4质粒，后续的试验可在短短3 d之内完成，这大大提高了试验效率。

综上，本研究应用 CRISPR/Cas9 系统，在大肠杆菌W3110菌株中建立起利用该系统进行基因敲除的试验平台，并获得了高效率的突变株。该方法高效简单，经济快捷，为构建大肠杆菌基因工程菌奠定了基础。