黑曲霉β-葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质研究

郭金玲，陈程鹏，周一郎，陈红吉，吕育财，任立伟，龚大春

（1.三峡大学 湖北省生物酵素工程技术研究中心，湖北 宜昌 443002；2.三峡大学生物与制药学院，湖北 宜昌 443002）

β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）又称β-D-葡萄糖苷水解酶，是纤维素酶系的重要组成成分，可以水解β-D-葡萄糖苷键释放出β-D-葡萄糖[1]，被广泛应用于生物燃料[2-3]、食品[4-6]、医药保健品[7-8]等诸多领域，具有广阔的市场应用前景。因此，国内外对β-葡萄糖苷酶研究日益增多，加快了其投入生产应用的步伐。

微生物产β-葡萄糖苷酶具有生长周期短，易于提取，操作成本低等优点。目前，国内外研究较多的β-葡萄糖苷酶产生菌为细菌中的芽孢杆菌属（Bacillus），真菌中的木霉属（Trichoderma）和曲霉属（Aspergillus）。黑曲霉产β-葡萄糖苷酶不仅酶活性高，同时，黑曲霉不产生有毒物质，安全可靠，是公认的安全微生物[9]。因此，黑曲霉在产β-葡萄糖苷酶方面显示了较大的潜力，为该酶的应用和开发提供更广阔的空间。目前已经报道了多种来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶，分子质量分布在67～330 kDa之间，最适催化温度为50～70 ℃，最适pH值为2.0～6.0，具有较广泛的多样性[4，10-13]。

本课题组前期已对实验室保藏黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的发酵产酶条件、β-葡萄糖苷酶在鲜人参皂苷生物转化中的应用、β-葡萄糖苷酶的固定化和初步纯化等进行了研究[14-17]。本研究拟对黑曲霉产的β-葡萄糖苷酶进行分离纯化和性质研究，以期进一步了解其酶学性质，为其后续应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

黑曲霉（Aspergillus niger）：实验室保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基[16]：马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基，马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，pH自然。

种子培养基[16]：葡萄糖60.0 g/L，麦芽粉8.0 g/L，硫酸铵10.0 g/L，磷酸二氢钾5.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基[16]：麦芽糖12.0 g/L，酵母膏4.0 g/L，磷酸二氢钾2.0 g/L，硫酸镁0.8 g/L，硫酸锰0.17 g/L，吐温80 0.2%，pH 5.5，121 ℃灭菌20 min。

1.1.3 试剂

水杨素（纯度≥99%）：上海源叶生物科技有限公司；3,5-二硝基水杨酸（分析纯）：上海顺强生物科技有限公司；季氨乙基-琼脂糖凝胶FF（Q-Sepharose FF）离子交换层析填料、苯基-琼脂糖凝胶6FF（Phenyl-Sepharose 6 FF）疏水层析填料、丁基-琼脂糖凝胶HP（Butyl-Sepharose HP）疏水层析填料：美国GE公司；蛋白质电泳试剂盒：上海碧云天生物科技有限公司；超滤离心管（10 kDa）：德国默克密理博公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

AR2140型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；SX-700型蒸汽灭菌器：日本Tomy公司；SW-CT-1D型净化工作台：苏州净化设备有限公司；ZQLY-180型振荡培养箱：上海知楚仪器有限公司；MX-307型落地高速冷冻离心机：日本Tomy公司；UV1800型紫外可见分光光度计：日本岛津公司；WH-861型微型旋涡混合仪：生工生物工程（上海）股份有限公司；BT1-100L-LCD型智能恒流泵、SBS-100-LCD型数控计滴自动部分收集器：上海琪特分析仪器有限公司；UVD-680-3型紫外检测仪：上海金达生化仪器有限公司；DYCZ-24DN型电泳仪：北京市六一仪器厂；WD-9405B型水平摇床：北京沃德生物医学仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液的制备

将甘油管保藏的黑曲霉孢子悬浮液划线接种于斜面培养基，28 ℃活化5～7 d。将活化后的黑曲霉转接于种子培养基中，于28 ℃、150 r/min摇床中培养48 h作为种子液。将种子液以10%（V/V）的接种量接种于发酵培养基，于28℃、150 r/min摇床中培养4 d，除去菌丝体得到β-葡萄糖苷酶粗酶液，保存于4 ℃冰箱备用。

1.3.2β-葡萄糖苷酶活力的测定

参照文献[16]测定β-葡萄糖苷酶活力。β-葡萄糖苷酶活力单位定义：在测定条件下，每分钟释放1 μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位（U/mL）。

1.3.3 蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[18]。

1.3.4β-葡萄糖苷酶的分离纯化

硫酸铵盐析[10]：取一定体积粗酶液于烧杯中，冰浴，采取两种方案进行盐析。方案1（分级盐析）：在搅拌下缓慢加入硫酸铵粉末，使其饱和度达到35%，4 ℃静置2 h使其完全沉淀，取盐析液10 000 r/min离心15 min，上清液中继续加入硫酸铵使其饱和度达到80%，4 ℃静置使其完全沉淀，10 000 r/min离心15 min，收集沉淀，缓冲液复溶后透析过夜。方案2（一步盐析）：直接加硫酸铵至饱和度达到80%。

Q-Sepharose FF离子交换柱层析：20 mmol/L用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）平衡色谱柱，取透析后粗酶液上样。采用含0.2 mol/L、0.4 mol/L、0.6 mol/L、0.8 mol/L和1.0 mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）进行梯度洗脱，洗脱流速为1 mL/min，收集各梯度洗脱液进行酶活性检测，合并有酶活性的洗脱液进行进一步纯化。

Phenyl-Sepharose6FF疏水层析柱层析：将经过离子交换层析后的酶液用超滤管浓缩并将缓冲液更换为含1.0 mol/L硫酸铵的20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0），上样后以降低硫酸铵浓度的方式进行梯度洗脱，即分别用含1.0 mol/L、0.8 mol/L、0.6 mol/L、0.4 mol/L、0.2 mol/L和0 mol/L硫酸铵的20 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）进行洗脱，收集有酶活性的洗脱液。

Butyl-Sepharose HP疏水层析柱层析：方法同Phenyl-Sepharose 6 FF层析柱层析进行梯度洗脱，洗脱流速为1.5 mL/min，收集有酶活性的洗脱液。

1.3.5β-葡萄糖苷酶蛋白纯度及相对分子质量的测定

酶蛋白纯度及相对分子质量的测定采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）法，SDS-PAGE条件：浓缩胶5%，分离胶10%；浓缩胶选用80 V固定直流电压，待进入分离胶时改用110 V直流电压。电泳结束后倒入考马斯亮蓝R250染色液，在摇床上振荡染色0.5 h，蒸馏水反复冲洗几次后加入脱色液（乙醇冰醋酸溶液），在摇床上振荡脱色至蛋白质条带清晰可见。

1.3.6β-葡萄糖苷酶的酶学性质

最适反应温度：在温度30～80 ℃条件下按照方法1.3.2测定酶活。将最高酶活定义为100%，分别计算不同反应温度下的相对酶活。

热稳定性：将待测酶液置于30～80℃条件下保温30min，冷却后按照方法1.3.2测定酶活。以未保温酶活为100%，分别计算在不同温度下保温后的相对酶活。

最适反应pH值：在pH值1.0～8.0条件下按照方法1.3.2测定酶活。将最高酶活定义为100%，分别计算不同pH值下的相对酶活。

pH值稳定性：在4 ℃条件下，将纯化后的酶液置于pH 1.0～8.0的缓冲液中处理3 h，按照方法1.3.2测定酶活。将未处理的酶活定义为100%，分别计算不同pH值下处理后的相对酶活。

2 结果与分析

2.1 β-葡萄糖苷酶的分离纯化

2.1.1 硫酸铵盐析

β-葡萄糖苷酶粗酶液经硫酸铵盐析后，测定总酶活、总蛋白含量、比酶活、纯化倍数及回收率，结果见表1。由表1可知，分级沉淀（方案1）的回收率为47.26%，低于一步盐析（方案2）（59.90%），但纯化倍数（2.84）较高，除去了更多的杂蛋白。为了在保证一定回收率的基础上达到更好的纯化效果，本实验采用硫酸铵饱和度为35%～80%的分级盐析方法。

表1 硫酸铵盐析结果Table 1 Results for ammonium sulfate precipitation

2.1.2 Q-Sepharose FF离子交换柱层析

Q-Sepharose FF离子交换层析洗脱曲线见图1。由图1可知，脱盐后的粗酶液经Q-Sepharose FF离子交换柱层析分离后，共得到4个洗脱峰，其中第3个洗脱峰具有β-葡萄糖苷酶活力，即β-葡萄糖苷酶在NaCl浓度达到0.6 mol/L时被洗脱下来，其余的洗脱峰均无β-葡萄糖苷酶活力，为杂蛋白。将0.6 mol/L洗脱液进行回收合并，测定得到总β-葡萄糖苷酶活力为27.42 U，总蛋白质含量为1.89 mg，比酶活为14.5 U/mg，纯化倍数达到7.04倍，回收率为24.66%。

图1 β-葡萄糖苷酶经Q-Sepharose FF离子交换层析洗脱色谱图Fig.1 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Q-Sepharose FF ion exchange column chromatography

2.1.3 Phenyl-Sepharose 6 FF疏水柱层析

Phenyl-Sepharose 6 FF疏水柱层析洗脱曲线见图2。由图2可知，粗酶液经Phenyl Sepharose 6 FF疏水柱层析分离后，共得到6个洗脱峰，其中第4个洗脱峰具有β-葡萄糖苷酶活力，即β-葡萄糖苷酶在硫酸铵浓度达到0.4 mol/L时被洗脱下来，其余的洗脱峰均无β-葡萄糖苷酶活力，为杂蛋白。将0.4 mol/L洗脱液进行回收合并，测定其总酶活为10.71 U，总蛋白质含量为0.15 mg，比酶活为71.40 U/mg，纯化倍数达到35.66倍，回收率为9.59%。

图2 β-葡萄糖苷酶经Phenyl Sepharose 6 FF疏水层析洗脱色谱图Fig.2 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Phenyl Sepharose 6 FF hydrophobic chromatography

2.1.4 Butyl-Sepharose HP柱层析

Butyl-Sepharose HP疏水柱层析洗脱曲线见图3。由图3可知，酶液经Butyl Sepharose 6 HP疏水柱层析分离后，共得到5个洗脱峰，其中第3个洗脱峰具有β-葡萄糖苷酶活力，即β-葡萄糖苷酶在硫酸铵浓度达到0.6 mol/L时被洗脱下来，其余的洗脱峰均无β-葡萄糖苷酶活力，为杂蛋白。将0.6 mol/L洗脱液进行回收合并，测定其总酶活为5.19 U，蛋白质含量为0.05 mg，比酶活为103.8 U/mg，纯化倍数达到50.39倍，回收率为4.65%。

图3 β-葡萄糖苷酶经Butyl Sepharose HP疏水层析洗脱色谱图Fig.3 Chromatogram of β-glucosidase after elution with Butyl Sepharose HP hydrophobic chromatography

2.1.5β-葡萄糖苷酶分离纯化结果

β-葡萄糖苷酶各步纯化结果见表2。

表2 β-葡萄糖苷酶纯化结果汇总Table 2 Summary of β-glucosidase purification results

2.2 β-葡萄糖苷酶分子质量的测定

β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE结果见图4。由图4可知，β-葡萄糖苷酶的分子质量约为116 kDa，与徐星等[10-11]报道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶分子质量大小相近，而NARASIMHA G等[12]报道的来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的分子质量约为95 kDa，王剑锋等[13]报道的来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的分子质量分别为102 kDa和97 kDa，与本研究报道的β-葡萄糖苷酶的分子质量存在较大差别，表明来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶具有广泛的多样性。

图4 黑曲霉产β-葡萄糖苷酶SDS-PAGE结果Fig.4 SDS-PAGE result of β-glucosidase from Aspergillus niger

2.3 β-葡萄糖苷酶酶学性质研究

2.3.1 最适反应温度和热稳定性

通常，随着反应温度的升高，酶反应速度加快，但是当温度升高到一定程度后，酶蛋白变性失活，反应速度随之降低。温度对黑曲霉β-葡萄糖苷酶活性的影响见图5。由图5可知，随着反应温度的升高该酶活性逐渐升高，当反应温度为60 ℃时酶活力最大，但是当温度超过60 ℃后酶活迅速降低，因此，确定该β-葡萄糖苷酶的最适反应温度为60 ℃，与KARAMI F等[19-20]报道的黑曲霉β-葡萄糖苷酶的最适反应温度相近。

图5 温度对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.5 Effect of temperature on the activity of β-glucosidase from Aspergillus niger

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的热稳定性结果见图6。由图6可知，该β-葡萄糖苷酶在30～50 ℃范围内较稳定，温度超过50 ℃后，β-葡萄糖苷酶的稳定性逐渐下降。因此，确定该β-葡萄糖苷酶在温度30～50 ℃范围内稳定性好。

图6 黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的热稳定性Fig.6 Thermostability of β-glucosidase from Aspergillus niger

2.3.2 最适反应pH值和pH稳定性

pH值会影响酶活性中心必需氨基酸的解离状态和底物的解离状态，从而影响酶的反应速度。pH值对黑曲霉β-葡萄糖苷酶活性的影响见图7。由图7可知，随着反应pH值的升高，β-葡萄糖苷酶活性呈先升高后下降的趋势，当反应pH值为5时，β-葡萄糖苷酶活性最高，因此，确定该β-葡萄糖苷酶的最适反应pH值为5。

图7 pH值对黑曲霉产β-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.7 Effect of pH value on the activity of β-glucosidase from Aspergillus niger

黑曲霉β-葡萄糖苷酶的pH值稳定性结果见图8。

图8 黑曲霉产β-葡萄糖苷酶的pH稳定性Fig.8 pH stability of β-glucosidase from Aspergillus niger

由图8可知，在pH 2.0～8.0的缓冲液中处理3 h，该β-葡萄糖苷酶仍然可以保留80%以上的酶活性，较好的pH稳定性利于该酶在不同领域的应用。因此，确定该β-葡萄糖苷酶在pH值2.0～8.0范围内稳定性好。

3 结论

本研究利用硫酸铵盐析、Q-Sepharose FF离子交换层析、Phenyl-Sepharose 6 FF疏水层析和Butyl-Sepharose HP疏水层析对黑曲霉来源β-葡萄糖苷酶进行分离纯化，并对其酶学性质进行了初步研究。结果表明，经硫酸铵分级盐析、3步柱层析后，β-葡萄糖苷酶的比酶活达到103.80 U/mg，纯化倍数达到50.39倍，回收率为4.65%。利用SDS-PAGE测定该β-葡萄糖苷酶的分子质量约为116 kDa。该酶的最适反应温度为60 ℃，最适反应pH值为5.0，在温度30～50 ℃、pH 2.0～8.0之间具有较好的稳定性，较宽的pH稳定性表明该酶有较好的潜在应用价值。