增强谷氨酸棒状杆菌羧化途径对有机酸产量的影响

陈 俊，曹 阳，汪定奇，李娟娟，易梦凡，周 卫，吴晓琴

(武汉科技大学化学与化工学院，湖北 武汉，430081)

利用微生物发酵法生产有机酸，具有原料来源丰富、产品成本低廉、食用安全性高等优点[1]，而谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum，C.glutamicum)则是经典的食品安全级微生物，其培养条件简单、生长速度快，并且全基因组序列已知，遗传背景清晰，利于遗传改造[2-4]，经遗传改造的C.glutamicum可以高效用于生产琥珀酸[5]、丙酮酸[6]和L-苹果酸[7]等有机酸。C.glutamicum经糖酵解所产生的丙酮酸在有氧条件下经过TCA循环最终生成草酰乙酸，在此循环中，多种有机酸如琥珀酸、富马酸和苹果酸等被合成；而在厌氧条件下，丙酮酸将通过还原TCA或rTCA途径，经草酰乙酸直接转化成苹果酸、富马酸和琥珀酸，该途径是合成四碳二羧酸得率较高的途径，丙酮酸通过固定二氧化碳，使得理论上的糖酸转化率高达200%[8]，因此，无论从有机酸的产率、安全性还是立体选择性等方面考虑，C.glutamicum都是非常理想的有机酸生产菌株。不过，野生型C.glutamicum虽在代谢途径中生成多种有机酸，但并不积累这些有机酸，故本课题组构建了阻断乙酸和乳酸合成途径的C.glutamicumCZ04重组菌株[9]，在此基础上，本文采用同源重组的方法，通过引入超氧化物歧化酶基因启动子(Psod)以增强羧化途径的关键酶活性，进而强化C.glutamicum的羧化代谢途径，同时检测了相应有机酸的积累情况，以期为微生物发酵技术在实践中的应用提供参考。

1 试验

1.1 材料及重组菌株的构建

1.1.1 培养基

LB液体培养基中胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠的质量浓度分别为10、5、10 g/L，在此基础上按15 g/L添加琼脂粉制得LB固体培养基。

LBG液体培养基中葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠的质量浓度分别为10、10、5、10 g/L，在此基础上按15 g/L添加琼脂粉制得LBG固体培养基。

BHIS液体培养基中胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、脑心浸粉、山梨醇的质量浓度分别为5、2.5、5、18.5、91 g/L，在此基础上按15 g/L添加琼脂粉制得BHIS固体培养基。

发酵种子液培养基中葡萄糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、NaAc的质量浓度分别为 20、5、2.5、5、2.5 g/L。

发酵培养基中葡萄糖、NaAc、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、MnSO4·4H2O、FeSO4·7H2O的质量浓度分别为20、5、0.75、0.75、5、0.5、0.2、0.02、0.005 g/L，VH和VB1的质量浓度均为0.2 mg/L。

1.1.2 主要试剂

质粒DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均为美国Omega公司产品；限制性内切酶为美国Thermo Fisher Scientific公司产品；T4 DNA ligase为宝日医生物技术(北京)有限公司产品，fastpfuPCR Mix DNA聚合酶购自北京佳兰生物科技有限公司；所用引物均由苏州金唯智生物科技有限公司合成；乙腈(色谱纯)购自国药集团化学试剂有限公司；其它均为国产分析纯试剂。

1.1.3 重组菌株的构建

本研究所用C.glutamicum出发菌株(编号CZ04)为本课题组前期构建，C.glutamicum的部分代谢路径如图1所示。

图1 C.glutamicum部分代谢流程图

在CZ04的ppc基因前敲入超氧化物歧化酶基因启动子(Psod)，具体步骤如下：以C.glutamicumATCC 13032的基因组DNA为模板，扩增ppc基因上、下游同源臂及Psod三个片段，采用融合PCR将上述三个片段融合，并将其克隆至pK19mobsacB载体，重组质粒命名为pK19mobsacB-Psod-ppc。采用同样的方法构建重组质粒pK19mobsacB-Psod-pyc。

通过电转化法[10-11]将重组质粒pK19mobsacB-Psod-ppc转入感受态细胞CZ04中，涂布到含有卡那霉素(30 μg/mL)的BHIS固体平板上，经初筛和复筛后，正确的重组菌株命名为CZ05，按同样方法构建重组菌株CZ06和CZ07。本研究中所用菌株和质粒列于表1，所用引物列于表2。

表1 菌株和质粒

表2 引物

1.2 检测方法

1.2.1 酶活测定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase，PPC)酶活测定参照文献[12-13]进行。丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PYC)酶活测定参照文献[14-15]进行。

1.2.2 菌体密度测定

挑取新鲜的单菌落，接种到LBG培养基中过夜培养，取1 mL菌液接种到种子培养基中并测定菌液初始OD600的值，之后每3 h测一次菌液浓度，直至衰亡期，每种菌株设置3个平行样。测定过程中，将菌液稀释一定的倍数，使用752N型紫外可见分光光度计检测细胞生长量，检测波长为600 nm。

1.2.3 葡萄糖浓度及有机酸含量测定

菌株在发酵培养基中转厌氧培养时，每12 h检测葡萄糖的浓度，所用仪器为SBA-40E型葡萄糖分析仪。

使用P680型高效液相色谱仪检测样品中的L-苹果酸、琥珀酸及丙酮酸含量，分析条件为：色谱柱为AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为KH2PO4、乙腈混合液二者体积比为99∶1， KH2PO4浓度为20 mmol/L，进样量为20 μL，紫外检测波长为210 nm，柱温为25 ℃，流速为0.5 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定

菌株CZ05、CZ06及CZ07的PCR鉴定结果如图2所示。已知用于同源重组的上、下游同源臂片段大小约为500 bp，psod片段大小约为200 bp。由图2(a)中的泳道1可知，当以重组菌株CZ05的基因组DNA为模板、以同源臂引物ppcU1和ppcD2扩增时，扩增产物为上游同源臂、启动子和下游同源臂三者融合片段，扩增条带大小介于1000～2000 bp之间，这与理论值1200bp相吻合；由图2(a)中的泳道2可知，当以对照菌株CZ04的基因组DNA为模板、以同源臂引物ppcU1和ppcD2扩增时，扩增产物为上、下游同源臂融合片段，因缺乏sod基因启动子，该片段介于1000～2000 bp之间但略小于泳道1相应值，这也与理论值(1000 bp)相一致；由图2(a)中的泳道3可知，当以CZ05基因组DNA为模板、以同源臂引物ppcU1和启动子引物sod-ppc-U2扩增时，扩增产物为上游同源臂、启动子二者融合片段，扩增条带大小介于500～1000 bp之间，这仍与理论值(700 bp)相吻合；图2(a)中的泳道4所示为以CZ04基因组DNA为模板、以同源臂引物ppcU1和启动子引物sod-ppc-U2扩增时的情形，由于对照菌株CZ04的ppc基因前面缺乏sod基因启动子，故而不能扩增出产物；图2(a)中的泳道5所示为以CZ05基因组DNA为模板、以启动子引物sod-ppc-U1和同源臂引物ppcD2进行扩增时的情形，扩增产物为启动子、下游同源臂融合片段，实测值与理论预期值(700 bp)一致，而对照菌株CZ04则未能扩增出条带(见图2(a)泳道6)。综合上述结果可以判断，sod基因启动子已成功敲入到ppc基因前面。至于重组菌株CZ06、CZ07，相应的鉴定结果(分别见图2(b)、图2(c))也均与预期相符，此处不再赘述。

(a)CZ05 (b)CZ06

(c)CZ07

2.2 酶活检测结果与分析

PCR鉴定证实sod基因启动子已成功敲入相应的靶基因前面，为了确定sod基因启动子是否能够增强靶基因表达，对靶基因ppc和pyc的编码产物进行了酶活检测与分析，结果如图3所示。由图3可见，与对照菌株CZ04相比，单独上调ppc基因的重组菌株CZ05，其PPC酶活提高了62%，而PYC酶活则略有降低；单独上调pyc基因的菌株CZ06，其PYC酶活提高了116%，PPC酶活也略有升高；同时上调ppc和pyc基因的菌株CZ07，其PPC酶活提高了67%，PYC酶活提高了120%。检测结果表明，将C.glutamicum超氧化物歧化酶基因sod启动子敲入ppc和pyc基因的上游，可以有效提高PPC和PYC这两种酶的活性，尤其对PYC酶活的促进作用更为显著，并且ppc和pyc基因双上调的菌株CZ07，其PPC和PYC酶活均高于单独上调ppc或pyc基因的菌株CZ05及CZ06。

(a)PYC

(b)PPC

2.3 菌株的生长特性

菌株CZ04、CZ05、CZ06、CZ07分别在种子培养基和发酵培养基中的生长情况检测结果如图4所示。从图4(a)中可以看出，各菌株在种子培养基中经摇瓶培养12 h后，相应生长周期均进入对数生长末期，其中对照菌株CZ04的生长速度最快，在培养15 h时即达到最大值，之后进入平台期。菌株CZ05、CZ06、CZ07生长速度达到最大值的时刻均比CZ04滞后约6 h，但四者的最大生物量没有显著差异。另外，单独上调PYC的CZ06与单独上调PPC的CZ05及PPC、PYC双上调的CZ07相比，前者的最大生物量较后两者略高，并且后两者最大生物量非常接近，这表明PPC的上调对菌株生长的影响占主导作用。从图4(b)中可看出，4种菌株都以较快速度在发酵培养基中生长，在培养阶段前18 h内，各菌株生长速度几乎相同，且均在培养24 h时达到最大浓度，此时转厌氧发酵效果最好。菌株按最大浓度由高到低排序，依次为CZ04、CZ06、CZ05、CZ07。综上所述，Psod启动子的敲入，虽大幅提高了PPC和PYC的酶活，但对菌株的生长速度却没有明显影响，这对于目的产物的积累是有利的。

(a)种子培养基

(b)发酵培养基

2.4 增强C.glutamicum羧化途径对有机酸积累的影响

为了考察增强羧化途径对有机酸积累的影响，将菌株在厌氧条件下培养72 h，发酵液中有机酸的成分和浓度测试结果如图5所示，相应葡萄糖消耗量见图6。由图5及图6数据计算可知，与出发菌株CZ04相比，单独上调PPC或PYC的菌株CZ05和CZ06，其相应的L-苹果酸产率分别提高了63.2%和29.2%，琥珀酸产率分别提高了25%和23.2%，而丙酮酸产率则分别下降了38.6%和18.0%，总产酸率分别提高了7.2%和4.8%，同时，葡萄糖消耗量分别提高了11.1%和5.5%。因此，当Psod分别单敲入时，相应的总产酸率及葡萄糖消耗量均有一定程度的增加，这表明强启动子的敲入增强了CZ05、CZ06的羧化代谢通路，使磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸更多地转化为草酰乙酸，再通过草酰乙酸进一步生成L-苹果酸及下游产物琥珀酸，而L-苹果酸的生成更依赖于丙酮酸的消耗转化。当同时上调PPC和PYC获得CZ07时，相应L-苹果酸产率提高了63.7%，丙酮酸产率下降了32.6%，琥珀酸的产率提高了35.7%，总产酸率提高了11.8%，葡萄糖消耗量提高了22.2%，总产酸率和葡萄糖消耗量的提升效果均优于单一上调PPC或PYC时的效果，这表明菌株CZ07的羧化途径在菌株CZ05和CZ06的基础上进一步得到强化。

图5 有机酸的检测

图6菌株的葡萄糖消耗

通过对野生型菌株进行代谢途径优化来提高目标产物的产率，一般有以下两个策略：第一，阻断底物流向非目标产物，即阻断底物的消耗；第二，加速底物向目标产物的转化。在本研究中，通过在催化底物向目标产物转化的关键酶基因前敲入强启动子Psod，增强关键酶活性，进而加速催化底物向产物的转化。需要指出的是，虽然pyc和ppc基因前面敲入的都是sod基因启动子，但本研究结果表明，敲入sod基因启动子对PYC酶活性的提升作用较其对PPC酶活性的提升作用更强，这应归因于PPC酶活会被胞内多种物质抑制[16]，在C.glutamicum中，二羧酸代谢产物对PPC酶活均有一定的抑制作用，天冬氨酸和苹果酸是PPC的强抑制剂，尤其天冬氨酸的抑制效果更强[17]。不过，在PPC中有一种氨基酸取代物D299N，可以减轻天冬氨酸的反馈抑制，提高草酰乙酸生成量以增强TCA循环并提高谷氨酸的产量[16]，这意味着PPC酶活性的提高，除了借助引入强启动子外，还可以联合使用有效的PPC拮抗抑制剂，从而最大限度地释放PPC的活性。此外，本研究中PPC酶活是在粗酶液条件下检测的，粗酶液中可能有一些成分会抑制PPC酶活性，导致测量值低于相应实际值。再则，在实际发酵生产过程中，胞内有机酸如苹果酸和天冬氨酸等的积累也会严重抑制PPC的活性，同时对其它关键酶亦有抑制作用[18-19]，造成有机酸合成能力下降。上调PPC和PYC，有利于有机酸的生成和积累，但是高浓度的有机酸又对PPC和PYC形成反馈抑制，因此，尽快地转移产物，减少产物反馈抑制，也是大量生产目标产物时必须考虑的因素。在本研究中，单独上调PPC或PYC的菌株CZ05和CZ06都能有效提高有机酸的产量，而PPC、PYC双上调的菌株CZ07，其PPC、PYC酶活以及产生有机酸的能力均高于PPC或PYC单独上调的菌株，这表明PPC和PYC可能在谷氨酸棒状杆菌的糖酸转换中存在协同作用。单独上调PPC或PYC时，菌株CZ05的PPC酶活提高了62%，而菌株CZ06的PYC酶活则提高了116%，但菌株CZ05产酸量却较菌株CZ06相应值高2.26%，这表明C.glutamicum在厌氧发酵过程中，PPC较PYC的羧化作用更强，当两者同时过表达时发挥了协同作用。但是，增强羧化途径后，相应L-苹果酸产量及葡萄糖消耗量的增幅并不是特别显著，这可能是有机酸的累积形成了较强的产物反馈抑制所致，因为在通常情况下，有机酸不会自发分泌到胞外。为了提高有机酸分泌到胞外的量，可以尝试改变发酵培养基成分，增加细胞壁的通透性，使胞内积累的物质更容易分泌到胞外，或者过表达有机酸转运蛋白，及时将产物运出细胞，这对持续发酵生产目的产物具有重要意义。

3 结语

利用同源重组的方法，在本课题组前期所构建菌株C.glutamicumCZ04的ppc和pyc基因前敲入强启动子Psod，成功构建了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)单独上调的重组菌株CZ05、丙酮酸羧化酶(PYC)单独上调的重组菌株CZ06以及PPC、PYC同时上调的重组菌株CZ07。经酶活检测，相比出发菌株CZ04，重组菌株CZ05的PPC 酶活提高了62%， CZ06的PYC 酶活提高了116%，而CZ07的PPC、PYC酶活则分别提高了67%、120%，三种重组菌株对应的有机酸得率分别为1.358、1.328、1.416 mol/mol葡萄糖。这表明，强启动子的引入有效提高了羧化途径关键酶活性，进而强化了C.glutamicum通过羧化途径产酸的能力，同时发现在厌氧条件下，上调PPC比上调PYC更有利于有机酸的积累。在本研究中，积累有机酸能力最强的是PPC和PYC同时上调的重组菌株CZ07，该菌株在厌氧发酵72h时L-苹果酸、琥珀酸的积累量分别达到0.761、0.228 mol/mol葡萄糖，主要副产物为丙酮酸。