血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶9、基质金属蛋白酶2与垂体瘤卒中及垂体瘤头痛的关系研究

金涛，周跃飞，王晰，杨西爱，陈鹤鸣

近年垂体瘤发病率逐渐升高，其可引发头痛、内分泌失调等症状；垂体瘤卒中是垂体瘤梗死或出血所导致的一组综合征，具有发病急、症状严重、病情进展快的特点［1］。目前，垂体瘤卒中的发生发展机制仍未完全明确。血管内皮生长因子（vascular endothlial growth factor，VEGF）不仅可介导血管新生，还可促进内皮细胞迁移、增加血管通透性并参与肿瘤细胞的侵袭及迁移［2］； 基质金属蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）-9和MMP-2对基膜具有较强的降解作用，与多种恶性肿瘤的浸润和迁移有关［3］。头痛虽是垂体瘤及垂体瘤卒中的共有症状，但并非发生于所有患者［4］。本研究分析VEGF、MMP-9、MMP-2与垂体瘤卒中及垂体瘤头痛的关系，以为临床诊疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2010年1月—2018年5月在安康市中心医院进行手术治疗的100例垂体瘤患者的病理组织标本。患者纳入标准：（1）经影像学检查显示鞍区占位病变，且经病理学检查确诊为垂体瘤；（2）首次接受手术。排除标准：（1）临床资料不全者；（2）既往有神经性头痛、血管性头痛等其他明确病因所致慢性头痛者；（3）其他部位、系统肿瘤患者；（4）既往接受激素治疗者；（5）严重心、肝、肾、肺等脏器功能衰竭者；（6）凝血功能障碍者。根据垂体瘤卒中发生情况将所有患者分为观察组（发生垂体瘤卒中）和对照组（未发生垂体瘤卒中），各50例。两组患者性别、年龄、病理类型、腺瘤分型、头痛发生率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。本研究经安康市中心医院伦理委员会审核批准（编号：论201806），并获得患者或家属知情同意。

表1 两组患者一般资料比较Table 1 Comparison of general information between the two groups

1.2 垂体瘤卒中的诊断标准［5］出现新发头痛症状或原有头痛症状加重，或突发恶心呕吐、视功能障碍、眼肌麻痹甚至意识不清等症状；CT、磁共振成像（MRI）等影像学检查显示鞍区占位病变且密度不均；术中在瘤内见陈旧性出血或坏死组织。

1.3 方法

1.3.1 VEGF、MMP-9、MMP-2免疫组织化学染色方法 取石蜡包埋的垂体瘤标本进行连续切片，厚度为4 μm，隔5取1，每个肿瘤组织取9张切片后随机取其中3张，分别进行VEGF、MMP-9、MMP-2免疫组织化学染色：将肿瘤组织切片经二甲苯常规脱蜡、乙醇溶液透明，经3%过氧化氢去除过氧化物酶，而后分别滴加Ⅰ抗（分别为兔抗人VEGF多克隆抗体、鼠抗人MMP-9多克隆抗体、鼠抗人MMP-2多克隆抗体），反应过夜后滴加Ⅱ抗，再进行DAB染色、苏木素复染，最后在光镜下观察染色结果。

1.3.2 免疫反应评分（immunorective score，IRS）［6］分别对VEGF、MMP-9、MMP-2免疫组织化学染色强度进行评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。其中阳性染色范围评分：每张切片中随机选择5个视野（×400），计数100个肿瘤细胞并统计阳性细胞数，5个视野平均阳性细胞数即该片阳性细胞百分比，随后进行记分（＜5%记0分，5%～25%记1分，26%～50%记2分，51%～75%记3分，＞75%记4分）。IRS=染色强度评分×染色范围评分。

1.4 观察指标 （1）观察两组 VEGF、MMP-9、MMP-2免疫组织化学染色情况，并比较两组VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS。（2）根据患者垂体瘤头痛发生情况分为头痛67例和非头痛33例，比较头痛和非头痛的垂体瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS。

1.5 统计学方法 应用SPSS 21.0统计学软件进行数据处理。计数资料以相对数表示，组间比较采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以（± s）表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料采用M（Q1，Q3）表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；垂体瘤卒中及垂体瘤头痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS之间的关系采用Spearman秩相关分析；绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线以分析VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS对垂体瘤卒中的预测价值，各曲线下面积（AUC）的比较采用Hanley-McNeil检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 观察组和对照组垂体瘤标本的VEGF、MMP-9、MMP-2免疫组织化学染色情况 垂体瘤标本HE染色见图1A。与免疫组织化学染色阴性对照（见图1B）比较，VEGF、MMP-9、MMP-2免疫组织化学阳性染色均呈棕黄色，主要表达于肿瘤细胞胞质，且观察组VEGF、MMP-9、MMP-2的染色强度高于对照组，见图1C～H。

图1 观察组和对照组患者垂体瘤标本的VEGF、MMP-9、MMP-2免疫组织化学染色情况（×400）Figure 1 The immunohistochemical staining condition of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in pituitary tumor specimens of observation group and control group

2.2 观察组和对照组VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比较 观察组VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 两组VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比较〔M（Q1，Q3），分〕Table 2 Comparison of IRS of VEGF，MMP-9，MMP-2 between the two groups

2.3 垂体瘤卒中患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS相关性分析 Spearman秩相关分析结果显示，垂体瘤卒中患者VEGF的IRS与MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相关（rs值分别为0.433、0.319，P值均＜0.05），MMP-9的IRS与MMP-2的IRS呈正相关（rs=0.471，P＜0.05），见图2。

图2 垂体瘤卒中患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS间关系的散点图Figure 2 Scatter plot of correlation between IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in patients with pituitary apoplexy

2.4 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS对垂体瘤卒中的预测价值 ROC曲线分析结果显示，VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS预测垂体瘤卒中的AUC分别为0.839〔95%CI（0.754，0.924）〕、0.954〔95%CI（0.914，0.993）〕、0.918〔95%CI（0.862，0.973）〕。MMP-9的IRS预测垂体瘤卒中的AUC大于VEGF的IRS，差异有统计学意义（Z=2.672，P=0.008）；而VEGF的IRS与MMP-2的IRS及MMP-9的IRS与MMP-2的IRS预测垂体瘤卒中的AUC比较，差异无统计学意义（Z=1.630，P=0.103；Z=1.172，P=0.241），见表3、图3。

表3 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS对垂体瘤卒中的预测价值Table 3 Predictive value of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in pituitary apoplexy

图3 VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS预测垂体瘤卒中的ROC曲线Figure 3 ROC curve of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in predicting pituitary apoplexy

2.5 头痛与非头痛的垂体瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比较 头痛的垂体瘤患者VEGF、MMP-9的IRS均高于非头痛的垂体瘤患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；但头痛与非头痛的垂体瘤患者MMP-2的IRS比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 头痛与非头痛的垂体瘤患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS比较〔M（Q1，Q3），分〕Table 4 Comparison of IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 between headache and non-headache patients with pituitary tumor

2.6 垂体瘤头痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS间的相关性分析 Spearman秩相关分析结果显示，垂体瘤头痛患者VEGF的IRS与MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相关（rs值分别为0.528、0.393，P值均＜0.05），MMP-9的IRS与MMP-2的IRS呈正相关（rs=0.603，P＜0.05），见图4。

图4 垂体瘤头痛患者VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS间关系的散点图Figure 4 Scatter plot of correlation between IRS of VEGF，MMP-9 and MMP-2 in patients with pituitary tumor headache

3 讨论

垂体瘤为常见颅内肿瘤，发病率为10%～15%，且近年呈升高趋势［7］。垂体瘤梗死或出血可导致垂体瘤卒中，患者表现为突发头痛或原有头痛症状加重、视觉障碍等，甚至昏迷或死亡［8］。目前，关于垂体瘤卒中的研究多围绕诱发因素、治疗方法等，针对其发生发展机制的研究尚处于起步阶段，其分子机制尚未明确［9］。

VEGF不仅能够通过促进血管内皮细胞增殖而促进血管生成，还具有促进内皮细胞迁移、增加血管通透性的生物学效应，因此其是肿瘤细胞侵袭和转移的促进因素，并且也参与了垂体瘤的侵袭过程［10-12］。MMP是调节细胞外基质降解的重要酶系，其中MMP-9对基膜的降解能力较强，其高表达不仅与多种恶性肿瘤的浸润和转移密切相关［13］，也与垂体瘤免疫逃逸有关［14］，而且VEGF可能协同参与了垂体瘤卒中的发生过程［10］；MMP-2对Ⅳ型胶原蛋白具有特异性降解作用，而Ⅳ型胶原蛋白为细胞外基质的主要组成成分［15］。有研究表明，MMP-9和MMP-2在垂体瘤蝶窦侵袭、海绵窦侵袭中均发挥了重要作用［6，16-18］，且二者可能是垂体瘤卒中的危险因素［19-20］。由于VEGF、MMP-9和MMP-2均与肿瘤血管的通透性及不稳定性有关，且可能均参与了垂体瘤卒中的发生，因此推测VEGF与MMP-9和MMP-2可能协同参与了垂体瘤卒中的发生发展。

本研究结果显示，观察组VEGF、MMP-9、MMP-2的IRS均高于对照组，表明VEGF、MMP-9、MMP-2可能参与了垂体瘤卒中的发生过程。Spearman秩相关分析结果显示，垂体瘤卒中患者VEGF的IRS与MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相关，MMP-9的IRS与MMP-2的IRS呈正相关，提示MMP-9、MMP-2可能与VEGF协同发挥了促进肿瘤血管新生及破坏新生血管基底膜的作用，进而导致垂体瘤卒中的发生［6］。于明圣等［6］研究表明，垂体瘤卒中患者VEGF、MMP-9的阳性表达水平高于非垂体瘤卒中患者，且二者呈正相关，本研究结果与之一致；VEGF可能通过与Endocan的正反馈机制协同促进了垂体瘤的发展［21］，并通过诱导MMP-9表达共同参与了垂体瘤卒中的发生过程［6］。本研究结果还显示，MMP-9的IRS预测垂体瘤卒中的AUC大于VEGF的IRS，提示MMP-9对垂体瘤卒中患者具有较高的预测价值。

垂体瘤卒中患者因出血、梗死、水肿导致垂体瘤快速扩张，进而引发头痛、恶心、视力异常等症状，其发生率可分别达87%、80%、34%～56%，高于非垂体瘤卒中患者［4］；然而，仍有部分垂体瘤患者，无论是否发生垂体瘤卒中均无明显头痛等症状，且其分子机制尚不明确［4］。本研究结果显示，头痛的垂体瘤患者VEGF、MMP-9的IRS高于非头痛的垂体瘤患者，分析原因为：VEGF、MMP-9不仅参与了垂体瘤的形成、迁移及浸润［5，22-23］，且VEGF可进一步诱导MMP-9表达而导致血管通透性增加、卒中后血肿增大或水肿加剧等［24-26］，因此可能进一步诱发或加重头痛。本研究结果还显示，垂体瘤头痛患者VEGF的IRS与MMP-9、MMP-2的IRS均呈正相关，MMP-9的IRS与MMP-2的IRS呈正相关，提示垂体瘤头痛可能与VEGF、MMP-9、MMP-2的相互作用有关。

综上所述，VEGF与MMP-9、MMP-2可能协同参与了垂体瘤卒中的发生过程，抗VEGF治疗、抑制MMP-9与MMP-2或许可成为预防垂体瘤卒中的潜在方法；垂体瘤头痛可能与VEGF、MMP-9、MMP-2的相互作用有关。但本研究样本量较少，且对于VEGF、MMP-9、MMP-2的表达情况仅限于病理学层面，未来将采用聚合酶链式反应（PCR）及Western blotting等方法进一步验证上述因子在垂体瘤病理组织中的转录及表达情况，且还需进行动物实验进一步验证结论。

作者贡献：金涛、陈鹤鸣进行文章的构思与设计，并对文章整体负责、监督管理；陈鹤鸣进行研究的实施与可行性分析；金涛、王晰、陈鹤鸣进行数据收集、整理、分析；周跃飞进行结果分析与解释；金涛撰写论文，并进行论文的修订；杨西爱负责文章的质量控制及审校。

本文无利益冲突。