钠钾泵Scr复合体对幼年哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的影响及其机制研究

黄河清，白燕

哮喘是一种常见疾病，可严重降低人们的生活质量并影响人类健康［1］，其发生、发展机制目前尚未完全阐明。研究表明，除炎症和气道高反应外，哮喘患者支气管气道结构也会发生改变，即气道重塑［2］。转化生长因子β1（transforming growth factor beta 1，TGF-β1）作为调节气道重塑的主要因子之一，可促进成纤维细胞前体分化为成肌纤维细胞并促使其增殖［3］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种多功能血管生成调节剂，在哮喘患者中呈过表达，且其表达水平与疾病活动度呈正相关，与支气管直径和气道高反应性呈负相关［4］。VEGF和TGF-β1均是气道重塑的经典标志物。气道结构细胞中气道上皮细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞均是白介素13（interleukin 13，IL-13）的靶细胞，故IL-13在气道重塑中起关键作用［5］。内皮素1（endothelin1，ET-1）作为一种具有促进生长特性的有效支气管收缩剂和内源性血管收缩剂肽，可参与香烟烟雾引起的血管和气道高反应［6］。有动物实验表明，ET-1会影响鼠哮喘模型的气道重塑［7］。三磷腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水解后钠泵会将3个胞内钠离子交换两个胞外钾离子［8］。研究表明，许多与Na+-K+-ATP酶相互作用的化合物可缓解急性或慢性哮喘患者的临床症状［9］。层粘连蛋白α4（LAMα4）普遍存在于内皮基底膜中。T淋巴细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞的外渗主要发生在高表达LAMα4的部位，表明LAMα4可能会促进外渗。钠钾泵Scr复合体亦称琥珀酸-细胞色素c氧化还原酶，其是由复合体Ⅱ和复合体Ⅲ组成。本研究旨在探究钠钾泵Scr复合体对幼年哮喘大鼠气道炎症和气道重塑的影响及其机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验时间为2019年7月—2020年8月。从军事医学科学院实验动物中心购买120只8周龄SD雄性大鼠，体质量为110～130 g，放置在没有特定病原体、温度和湿度可控的环境中，大鼠可随意进水和食物。

1.2 实验分组及干预方法 将120只SD雄性大鼠随机分为对照组、哮喘组和治疗组，每组40只。对照组大鼠于实验第1天腹腔注射5%磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）1 μl+氯化钠溶液 100 μl。哮喘组大鼠先制备哮喘模型［10］，具体如下：实验第1天和第14天，腹膜注射乳化的卵清蛋白（OVA，Ⅴ级）100 μg致敏；实验第25～27天，通过大鼠鼻内递送OVA 100 μg+PBS 50 μl。造模成功后，腹腔注射二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）1 μl+氯化钠溶液100 μl。治疗组大鼠先制备哮喘模型，方法同哮喘组，造模成功后给予钠钾泵Scr复合体药物（Sigma公司生产），具体用法：钠钾泵Scr复合体药物0.3 mg/kg溶解在20 mg/ml的DMSO中，并采用PBS稀释至1 ml，腹腔注射。实验结束后（即实验第28天）检测三组大鼠相关指标。本实验已通过武汉市东西湖区人民医院动物伦理委员会审核批准。

1.3 检测方法

1.3.1 实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR） 使用TRIzol试剂（上海碧云天生物技术有限公司生产，生产批号：20190258A）从肺组织中提取总RNA，并采用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq™一式三份进行qPCR。热循环条件：95 ℃变性 1 min，60 ℃退火 10 s，72 ℃延伸 10 s，共40个循环。内参基因为GAPDH，采用2-ΔΔCt方法计算Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相对表达量。

1.3.2 蛋白质印迹法 使用放射免疫沉淀测定法（RIPA）裂解缓冲液（上海碧云天生物技术有限公司生产，生产批号：201801102D）从肺组织中提取蛋白质。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶上通过电泳分离总蛋白60 μg，转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（Millipor公司，美国），在室温下用含TBST的5%脱脂奶粉封闭1 h。膜与一抗在4 ℃环境下孵育过夜，与辣根过氧化物酶（上海碧云天生物技术有限公司生产，生产批号：20180112D）偶联的抗兔二抗〔1∶5 000；安诺伦（北京）生物科技有限公司生产〕在室温下孵育1 h。使用Fusion Fx7图像采集系统（Vilber Lourmat公司，法国），通过ECL化学发光试剂（Beyotime生物技术研究所）捕获化学发光图像，使用Image J软件通过光密度测定法定量测定肺组织Scr及LAMα4相对表达量。

1.3.3 肺组织病理学检查 支气管肺泡灌洗后获得完整的左肺，并在4%的低聚甲醛中固定24 h。将样品脱水并包埋在石蜡中，切成4 μm的组织切片。分别采用苏木素-伊红（HE）（上海碧云天生物技术有限公司生产，生产批号：20180560M）、高碘酸-席夫（PAS）（上海碧云天生物技术有限公司生产，生产批号：20190956X）染色并分析切片。HE染色用于评估支气管周围和血管周围炎性细胞浸润情况，PAS染色用于评估杯状细胞增殖情况。由两名对实验不知情的观察员评估肺组织炎症病变程度，肺组织炎症病变程度由轻到重分为4级，分别记为0～3分［11］，其中无炎症为0级（记为0分），偶有炎性细胞套扎为1级（记为1分），大多数支气管或血管被薄层包围为2级（记为2分），大多数支气管或血管有一层较厚的炎性细胞为3级（记为3分）。如果炎症病变程度为2～3级，则增加0.5分，支气管周围和血管周围肺组织炎症评分之和为肺组织炎症评分。使用Image Pro Plus 6.0软件测量PAS阳性面积占比。

1.3.4 免疫组织化学法（immunohistochemistry，IHC） 采用免疫组织化学EnVision二步法染色，每个载玻片随机选择3个视野（×250），使用具有Image-pro Plus医学图像分析系统的Olympus Cx31显微镜（Olympus公 司， 日 本） 定量测定 TGF-β1（ 抗 TGF-β1，1∶100稀释；上海碧云天生物技术有限公司生产，生产批号：20190523B）和VEGF（抗VEGF，1∶100稀释；上海碧云天生物技术有限公司生产，生产批号：20190630K）表达量。

1.3.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） 采用ELISA试剂盒（eBioscience公司，美国）定量检测肺组织中IL-13、ET-1含量，并严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件（美国IBM公司）进行数据处理。符合正态分布的计量资料以（± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr、LAMα4相对表达量 三组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘组和治疗组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr相对表达量低于对照组，LAMα4相对表达量高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr相对表达量高于哮喘组，LAMα4相对表达量低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 三组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相对表达量比较（± s）Table 1 Comparison of relative expression levels of Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase，Scr and LAMα4 in lung tissue among the three groups

表1 三组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Scr及LAMα4相对表达量比较（± s）Table 1 Comparison of relative expression levels of Na+-K+-ATPase，Ca2+-ATPase，Scr and LAMα4 in lung tissue among the three groups

注：ATP=三磷酸腺苷，LAMα4=层粘连蛋白α4；与对照组比较，aP＜0.05；与哮喘组比较，bP＜0.05

组别 只数 Na+-K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶 Scr LAMα4对照组 40 1.83±0.14 2.55±0.24 4.78±0.32 1.89±0.14哮喘组 40 0.66±0.12a 0.89±0.13a1.55±0.13a 8.47±0.26a治疗组 40 1.64±0.13ab 2.18±0.24ab3.47±0.28ab4.11±0.36ab F值 17.292 13.171 13.907 13.748 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 肺组织炎症评分和PAS阳性面积占比 三组大鼠肺组织炎症评分和PAS阳性面积占比比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘组和治疗组大鼠肺组织炎症评分高于对照组，PAS阳性面积占比大于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组大鼠肺组织炎症评分低于哮喘组，PAS阳性面积占比小于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。与对照组大鼠相比，哮喘组大鼠细支气管周围和血管周围存在更多的炎性细胞浸润及大量的杯状细胞，治疗组较哮喘组大鼠炎性细胞浸润及杯状细胞减少，见图1。

图1 三组大鼠肺组织病理学检查结果（×200）Figure 1 Pathological examination results in lung tissue of the three groups

表2 三组大鼠肺组织炎症评分和PAS阳性面积占比比较（±s）Table 2 Comparison of inflammation score and PAS positive area in lung tissue among the three groups

表2 三组大鼠肺组织炎症评分和PAS阳性面积占比比较（±s）Table 2 Comparison of inflammation score and PAS positive area in lung tissue among the three groups

注：PAS=高碘酸-席夫；与对照组比较，aP＜0.05；与哮喘组比较，bP＜0.05

组别 只数 炎症评分（分） P A S阳性面积占比（%）对照组 4 0 0.5 3±0.0 6 0.8 8±0.2 1哮喘组 4 0 2.8 7±0.1 2 a 6.7 8±0.3 4 a治疗组 4 0 1.3 5±0.1 7 ab 4.2 3±0.2 6 ab F值 1 2.7 3 8 1 2.7 3 8 P值 ＜0.0 0 1 ＜0.0 0 1

2.3 肺组织TGF-β1和VEGF表达情况 三组大鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘组和治疗组大鼠肺组织中TGF-β1和VEGF表达高于对照组，治疗组大鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3、图2。

图2 三组大鼠肺组织免疫组织化学染色结果（SP染色，×200）Figure 2 Immunohistochemical results in lung tissue of the three groups

表3 三组大鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达比较（±s）Table 3 Comparison of expression level of TGF-β1 and VEGF in lung tissue among the three groups

表3 三组大鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达比较（±s）Table 3 Comparison of expression level of TGF-β1 and VEGF in lung tissue among the three groups

注：TGF-β1=转化生长因子β1，VEGF=血管内皮生长因子；与对照组比较，aP＜0.05；与哮喘组比较，bP＜0.05

组别 只数 T G F-β 1 V E G F对照组 4 0 3.4 7±0.3 2 2.7 8±0.1 1哮喘组 4 0 1 1.5 7±1.1 3 a 8.9 8±0.2 3 a治疗组 4 0 6.3 4±0.1 8 ab 4.6 7±0.2 2 ab F值 1 4.8 2 9 1 6.2 8 9 P值 0.0 1 3 0.0 0 8

2.4 肺组织IL-13和ET-1 三组大鼠肺组织IL-13和ET-1比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；哮喘组和治疗组肺组织大鼠IL-13和ET-1高于对照组，治疗组大鼠肺组织IL-13和ET-1低于哮喘组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 三组大鼠肺组织IL-13和ET-1比较（±s，pg/mg）Table 4 Comparison of IL-13 and ET-1 in lung tissue among the three groups

表4 三组大鼠肺组织IL-13和ET-1比较（±s，pg/mg）Table 4 Comparison of IL-13 and ET-1 in lung tissue among the three groups

注：IL-13=白介素13，ET-1=内皮素1；与对照组比较，aP＜0.05；与哮喘组比较，bP＜0.05

组别 只数 IL-13 ET-1对照组 40 130.27±8.29 15.33±1.45哮喘组 40 324.66±14.82a 42.92±1.48a治疗组 40 189.07±12.03ab 26.82±2.93ab F值 18.927 13.930 P值 0.016 0.007

3 讨论

哮喘是一种慢性气道炎性疾病，与气道炎症和气道结构改变有关，而气道炎症和气道重塑均可导致气道高反应。目前，支气管哮喘的常见治疗方法是吸入长效β2-肾上腺素激动剂和糖皮质激素，以迅速缓解急性哮喘症状，减轻支气管收缩和气道炎症，但部分患者对联合用药依从性较差或存在不良反应。因此，寻找补充疗法（尤其是植物疗法）及有效控制气道重塑的药物已成为哮喘新的研究方向。

既往研究表明，Na+-K+-ATP酶活性药物具有抑制哮喘的作用［12］，质子泵抑制剂能有效缓解咳嗽症状［13］。体液和轴突的钠泵会调节膜电位，而抑制其调节作用将会抑制动作电位的产生。研究表明，钠泵调节剂会选择性作用于同工酶［14］。本研究结果显示，哮喘组和治疗组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相对表达量低于对照组，治疗组大鼠肺组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶相对表达量高于哮喘组，提示Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶表达下调可能与哮喘发生有关。

层粘连蛋白（LAM）是一组异源三聚体蛋白质，由5个α、3个β、3个γ链组成，其与胶原蛋白Ⅳ、尼古丁和蛋白聚糖一起构成了基底膜的主要功能成分。在健康肺组织中，LAMα2、α3、α5、β1、β2、β3、γ1及γ2存在于气道上皮下的基底膜中，而LAMα4、β1、β2和γ1存在于气道平滑肌基底膜中［15-16］。研究表明，气道平滑肌质量增加可能与气道平滑肌细胞在增生和收缩表型之间转换有关，暴露于增生刺激会诱导增生的气道平滑肌表型［17］。本研究结果显示，哮喘组和治疗组大鼠肺组织LAMα4相对表达量高于对照组，治疗组大鼠肺组织LAMα4相对表达量低于哮喘组。本研究结果还显示，哮喘组和治疗组大鼠肺组织炎症评分高于对照组，PAS阳性面积大于对照组；治疗组大鼠肺组织炎症评分低于哮喘组，PAS阳性面积小于哮喘组，提示钠钾泵Scr复合体可有效减轻幼年哮喘大鼠气道炎症。

目前，钠钾泵在分子层面如何抵抗气道重塑及涉及哪些下游分子和信号传导途径仍不清楚。气道重塑的主要改变包括气道上皮完整性破坏、细胞外基质沉积、新血管形成、血管重塑及黏液腺增生，尤其是气道平滑肌细胞增生和肥大。研究表明，哮喘患者气道平滑肌细胞数量异常增多，且其数量与哮喘持续时间及严重程度有关［18］。VEGF和TGF-β1均是气道重塑的经典标志物。理论上讲，气道平滑肌质量增加可通过细胞增殖、细胞肥大或两者实现。IL-13是由活化的T细胞、嗜碱粒细胞或肥大细胞产生的Th2型细胞因子［19］，其是变应原诱导的气道高反应的重要递质，可直接或单独调节气道平滑肌细胞，而不依赖于炎性反应，其在气道平滑肌细胞、成纤维细胞、内皮和上皮细胞诱导的气道重塑中起关键作用。ET-1是气道平滑肌细胞的促分裂原和收缩激动剂，支气管肺泡液中ET-1水平升高与气道高反应和哮喘严重程度有关。机械压缩支气管上皮细胞有助于气道平滑肌细胞的增殖和基础收缩，而增强的增殖和收缩取决于上皮细胞衍生的ET-1。本研究结果显示，哮喘组和治疗组大鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达高于对照组，治疗组大鼠肺组织TGF-β1和VEGF表达低于哮喘组；哮喘组和治疗组大鼠肺组织IL-13和ET-1高于对照组，治疗组大鼠肺组织IL-13和ET-1低于哮喘组，提示钠钾泵Scr复合体可抑制TGF-β1、VEGF、IL-13、ET-1释放，进而抑制气道重塑。

综上所述，钠钾泵Scr复合体可抑制幼年哮喘大鼠气道炎症及气道重塑，其机制可能与调控LAMα4表达及抑制TGF-β1、VEGF、IL-13和ET-1的释放有关。

作者贡献：黄河清进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，撰写并修订论文，负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理；白燕进行数据收集、整理、分析，结果分析与解释。

本文无利益冲突。