种植体表面液相沉积法构建聚多巴@氯己定抗菌涂层

殷保藏，李向阳,3，王银龙

（1.安徽医科大学口腔医学院，安徽 合肥，230022；2.安徽医科大学附属口腔医院，安徽 合肥，230032；3.安徽省口腔重点实验室，安徽 合肥，230022）

自上世纪中期口腔种植技术出现以来，种植牙因其无需损伤邻牙、能恢复良好的咀嚼功能、舒适美观等优点，从众多的缺失牙修复技术中脱颖而出，在临床上的应用越来越多[1]。然而，在种植体植入的早期阶段，种植体因细菌导致的感染会引起种植体周围支持组织的丧失，最终导致种植失败[2]。Fürst等研究表明，微生物菌群在种植体植入30分钟后就已经开始在其表面定植[3]，并随着细菌种类和数量的增加逐渐形成生物膜。由于致密的菌群生物膜能够抵抗抗生素的作用[4]，所以仅仅在种植术前术后使用抗生素并不能完全解决种植体周围感染问题。因此对种植体表面进行处理赋予其一定的抗菌能力，日益成为研究热点。

对种植体表面抗菌化处理的方法多种多样，其中在种植体表面形成抗菌涂层是一种对种植体表面改性的重要方法。目前抗菌涂层使用的抗菌材料主要包括无机抗菌材料（银[5]、铜[6]、锌[7]、氟及氟化物[8]等）和有机抗菌材料（抗菌肽[9]、天然多酚类[10]等）。含银的抗菌材料虽然拥有良好的抗菌效果，但是因为其潜在的安全风险，已经被FDA由二类医疗器械升格为三类医疗器械严格申报和管理。抗菌肽和天然多酚等抗菌方式则因为抗菌谱较窄，难以实现对口腔复杂菌群的抗菌效果。氯己定是一种阳离子表面活性剂，具有非常强的广谱抗菌作用，是口腔临床主要使用的抗菌剂之一[11]。本研究通过简单的水相沉积法，在钛基底表面先沉积一层pDA膜，然后通过共价接枝氯己定，在钛基底表面制备了pDA@CHX抗菌涂层。

1 材料与方法

1.1 一般材料和实验分组

1.1.1 一般材料

纯钛购自山西宝鸡有色金属有限公司；MC3T3-E1 Subclone 14细胞购自中国科学院细胞库；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）购自明舟生物有限公司；多巴（Dopa）、醋酸氯己定、罗丹明123（Rhodamine 123）购自上海阿拉丁公司；DMEM培养基、胰酶、胎牛血清（Fetal bovineserum，FBS）购自美国Sigma公司；

1.1.2 实验分组

实验共分为8组，分别为纯钛组，实验组按氯己定浓度0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL分为7组；将纯钛组标记为Control，氯己定浓度为0组标记为pDA@CHX（0），氯己定浓度为0.05 mg/mL组标记为pDA@CHX（0.05），氯己定浓度为0.1 mg/mL标记为pDA@CHX（0.1），后同上。

1.2 涂层制备与表征

将纯钛棒（TA3）切割成直径10 mm，厚度2 mm的钛片，依次经80目，240目，500目，1200目，2000目砂纸抛光；然后依次在丙酮，无水乙醇，去离子水中，超声清洗10 min，烘干备用。采用简单的水相沉积法构建涂层。称取一定量的多巴盐固体粉末加入1.21 mg/mL的Tris缓冲溶液中，混匀后得到3 mg/mL的多巴Tris缓冲溶液；分别称取一定量的醋酸氯己定固体粉末加入去离子水中，混匀后得到浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/mL的醋酸氯己定溶液。将钛片浸泡于3 mg/mL的多巴Tris缓冲溶液中，室温下静置24 h后取出钛片，去离子水中经超声清洗两次，时长分别为3 min，2 min，吹干；再将钛片浸泡于不同浓度的氯己定溶液中，室温静置24 h后取出钛片，去离子水中经超声清洗两次，时长分别为3 min，2 min，然后吹干备用。每组各选取1个样品干燥后喷金30秒，利用扫描电子显微镜（HitachiS-480,SEM）观察表面形貌的变化。每组各选取5个样品，测量其表面水接触角的大小。每组取1个样品进行X射线光电子能谱检测，检测样品表面涂层中的化学元素组成。

1.3 抗菌性能检测

抗菌性能检测主要通过抑菌环实验和平板涂布法来评价涂层的抗菌性能。纯钛组和各个浓度梯度实验组均设置三个平行样，实验使用的菌种为金黄色葡萄球菌。称取一定量的脑心浸液琼脂固体粉末（BHI琼脂）溶解于蒸馏水中，121 ℃高压灭菌15 min，室温下降温至40 ℃左右，取无菌培养皿，倒入15 ml左右BHI琼脂，室温下冷却凝固备用；称取一定量的脑心浸液肉汤（BHI肉汤）固体粉末溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15 min，室温冷却备用。在进行实验前，将冷冻保存的菌种复苏，划线法接种至琼脂培养皿内，放入生化培养箱内（37℃，5% CO2）培养24 h；然后使用接种环挑取单一菌落，接种至20 mL BHI肉汤培养基内，培养8 h，获得菌液备用。

1.3.1 抑菌环实验

在无菌超净台内，使用紫外灯灭菌，将样品正反面均照射40 min后备用；取80 μL上述菌液加入琼脂皿内，并使用涂布器将菌液均匀地涂布在琼脂表面，将无菌样品正面轻轻放置于琼脂表面，使其与琼脂完全接触，放入恒温生化培养箱内培养，24 h后观察实验结果，测量抑菌环直径。

1.3.2 平板涂布法

将灭菌后的样品放入无菌24孔板内，在样品表面滴入80μL菌液，确保菌液不会从样品表面滴落，然后将孔板放入生化培养箱内培养4h后取出，每孔加2mL BHI肉汤培养基，继续放入培养箱内培养，24h后取出；将孔板内的液体吹匀，用BHI肉汤稀释104倍后，取200μL滴入琼脂皿内，涂布均匀，将培养皿放入培养箱内培养24 h后，观察不同样品表面的细菌数量。

1.4 细胞相容性检测

通过荧光染色实验，对照组和各个浓度梯度实验组均设置三个平行样。实验使用细胞种类为MC3T3-E1。将灭菌的样品放入无菌24孔板内，取适当生长周期，生长状态良好的的MC3T3-E1细胞，去除液体培养基，PBS清洗后，使用0.25%胰酶消化，高速离心机800 r离心8 min，去除上部液体，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬，计数板计数后，调细胞浓度为1×104/mL；每孔加入1 mL的细胞重悬液，然后分别培养1天，3天后进行荧光染色实验。将培养了1天，3天的24孔板分别按时取出，将孔板内的样品取出，用生理盐水轻轻冲洗两次，并放入新的24孔板内；每个孔内加入2 mL 2.5%的戊二醛，室温下固定1 h；然后用生理盐水轻轻冲洗样品表面2次，吹干表面水分；在黑暗环境中，用罗丹明123染色剂染色30 min，用生理盐水清洗，吹干；使用荧光显微镜观察样品表面的细胞生长形态。

2 结果

2.1 材料学表征

2.1.1 扫描电镜

为了观察氯己定接枝前后涂层表面形貌的差异以及不同的氯己定接枝浓度是否具有差异，本研究使用SEM对涂层的表面形貌进行观察。如图1所示,对钛表面进行多巴聚合涂层的改性使钛表面形成了一层部分球状突起的涂层。在接枝了氯己定之后，涂层表面的球状突起明显增多，证明该氯己定接枝涂层的成功制备。

图1 不同样品的扫描电镜结果

2.1.2 水接触角

为探究该涂层的表面亲水性能，对各分组的样品进行了水接触角测定。图2结果显示，多巴聚合涂层的构建明显改善了纯钛表面的亲水性，但是由于氯己定为强阳离子表面活性剂，具有一定的疏水性，随着氯己定浓度的增高，涂层的疏水性增强，也从一定程度上证明了氯己定的成功接枝。

图2 不同样品接触角结果

2.1.3 X 射线电子能谱

图3为XPS检测的各组样品表面的全谱图。结果显示随着氯己定的接枝，涂层表面出现了氯己定的特征元素氯原子，直观的证明了氯己定的成功接枝。并且氯元素在表面占比2.74%，证明氯己定接枝量相对较高，预期能够实现较强的表面抗菌效果。

2.2 抗菌性能检测

2.2.1 平板涂布实验

图4为对照组和各实验组样品的细菌涂板实验结果。纯钛组和氯己定浓度为0 mg/mL时，涂板表面长满了细菌；相反，当氯己定浓度为0.05 mg/mL时，该涂层就已经表现出良好的抗菌性，涂板表面没有观察到细菌生长。

图3 氯己定接枝前后XPS 全谱图

图4 不同样品稀释涂布平板法结果

2.2.2 抑菌环实验

随后，对涂层释放的氯己定的抗菌能力进行评价，进行了抑菌环实验。如图5结果显示，纯钛组和氯己定浓度为0 mg/mL时，未载氯己定的表面，未出现明显的抑菌圈，随着表面氯己定的接枝，样品表面出现了明显的抑菌圈，当氯己定浓度达到1.6 mg/mL时，在样品周围形成的抑菌环直径可达14 mm左右。

图5 不同样品抑菌环结果

2.3 细胞相容性检测

荧光染色实验 图6.为样品表面接种细胞后分别培养1，3天后用罗丹明123染色后荧光显微镜下观察结果。由图可见，即使氯己定浓度升高至1.6 mg/mL时，细胞增殖良好，涂层仍然保持了优越的生物相容性。

图6 不同样品表面细胞罗丹明123 染色结果

3 讨论

由于钛及其合金优异的综合性能（生物相容性、机械性能和低密度等），被认为是牙种植体的最佳材料[12]。然而，越来越多的研究报告了与钛种植体相关的短期和长期并发症，其中最为重要的并发症就是由细菌感染引起的种植体周围炎，种植体周围炎最终可能会导致治疗的失败[13]。

目前，主要研究的抗菌涂层包括Ag+，Zn2+，Cu2+等金属离子，抗菌肽以及抗细菌黏附涂层等[14]。其中，金属离子涂层对生物细胞的作用方式主要是产生活性氧以及与细胞DNA结合进而灭活生物细胞的两种方式[15]，对细菌没有特异性，即在抗菌的同时会对细胞产生相同的抑制效果，因此缺乏生物安全性,一定程度上限制了其在生物材料领域的使用。抗菌肽用于表面改性是近年来抗菌表面构建的研究热点，然而，抗菌谱较窄以及天然抗菌肽抗菌能力有限是抗菌肽表面改性不可回避的问题[16]，且抗菌肽价格偏高，临床应用价值有限。抗黏附涂层能够通过形成水化层抑制微生物黏附，然而水化层的抗黏附性能是无差别抗黏，同时水化层的形成对表面结构有较强的依赖性，一般适用于流体环境抗黏改性，对于种植体的改性可移植性不强[17,18]。Campbell.等通过表面诱导矿化技术形成羟基磷灰石涂层，在形成涂层的同时掺入氯己定，研究结果表明掺入氯己定组有明显的抗菌效果，没有掺入氯己定组未表现出抗菌效果，证明了氯己定赋予了该涂层良好的抗菌性能[19]，但是需要多次沉积。

本研究选择贻贝灵感的多巴在基底构建富羟基的聚多巴涂层，再通过羟基和具有胍基的氯己定反应，形成转化涂层。氯己定作为一种广谱抗菌剂，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具极强的抗菌性，抗菌谱广且很少有细菌对氯己定有耐药性，因此被广泛的应用于临床上，用于口腔内手术术前杀菌和局部术区消毒等[20]。本研究涂层制备方法简单高效，所制备的涂层可以完整覆盖基底，实现无功能钛的表面抗菌功能改性。SEM和XPS证明了pDA涂层的形成和氯己定的成功接枝。为了进一步评价该涂层的抗菌能力，本研究选取了金黄色葡萄球菌作为指示菌，进行了抑菌环实验，相比对照组和未接枝氯己定组，接枝氯己定组钛片周围可以形成明显的抑菌环，证明了其良好的抗菌性能。体外细胞实验选取了MC3T3-E1细胞，荧光染色实验结果表明了实验组与对照组的细胞形态和增殖没有明显差异，证明了其良好的细胞相容性。

综上所述，为解决种植体周围炎的发生，本研究通过简单易行的水相沉积法在钛表面制备了pDA@CHX涂层，并对其抗菌性能和生物安全性进行了初步探究，为种植体周围炎的预防提供了新的思路。