过表达c-SKI抑制异丙肾上腺素诱导的小鼠心肌纤维化

张 颖，向 燕，张 岳，王 娟

(新疆医科大学第五附属医院 心血管内科，新疆 乌鲁木齐 830011)

心肌纤维化(cardiac fibrosis)是多种心血管系统自身疾病或代谢和免疫系统疾病导致心肌继发性损害等共有的病理过程。心肌纤维化与疾病预后密切相关，患者发生心肌纤维化后心力衰竭及死亡的风险均显著增加[1]。内皮细胞间质转化(endothelial-mesenchymal transition，End-MT)最早作为胚胎发育过程中的一个生理现象，直到证实纤维化的心肌组织中约35%的成纤维细胞是由内皮细胞转化而来，由此认为End-MT是心肌纤维化进程中的重要机制[2]，近年来备受关注。原癌基因c-SKI(cellular Sloan-Kettering institute，c-SKI)是从反转录病毒(avian Sloan-Ketter-ing viruses)中分离出来的，在发育和组织稳态中都有重要作用，涉及神经、造血、肿瘤、遗传和代谢性疾病等多个方面，其关键作用机制就是对TGF-β1/Smad信号通路的负性调节作用[3]。前期研究发现，miRNA-155和miRNA-17可以靶向结合c-SKI，在冠脉内皮细胞中负性调控c-SKI的表达[4]，然而其能否有效改善小鼠心肌纤维化尚未得到验证。本研究利用异丙肾上腺素(isoprenaline,ISO)诱导的小鼠心肌纤维化模型，旨在探讨c-SKI是否通过抑制End-MT而发挥抑制心肌纤维化的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级8周龄雄性 C57小鼠，共40只，体质量(20±2)g[新疆医科大学实验动物研究中心提供许可证号：SCXK(新)2011-0004]，小鼠在实验过程中的处理符合动物伦理学的要求。

1.1.2 主要试剂：c-SKI慢病毒(c-SKI lentivirus,LV-SKI)(湖南长沙赢润生物技术有限公司)；Masson染色试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司)；RIPA 裂解液、BCA蛋白定量分析试剂盒和Pierce ECL化学发光底物显色(Thermo Fisher Scientificals公司)；c-SKI抗体、CD31抗体、Snail抗体和GAPDH(Cell signaling technology公司)，α-SMA抗体、vimentin抗体、Twist抗体和Slug抗体(Abcam公司)；辣根过氧化物酶的二抗(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物的分组和处理：将小鼠分为对照组(n=10)和模型组(n=30)。皮下注射ISO 5 mg/kg，后续以2.5 mg/kg注射至第30天。2周后c-SKI慢病毒感染模型组(LV-SKI group)，分别在第18、21、24、27、30 d给予尾静脉注射LV-SKI慢病毒(100 μL，滴度1×108TU)，及对照病毒感染模型组(LV-NC group)，注射LV-NC慢病毒(100 μL，滴度1×108TU)每组各10只。所有小鼠均予标准饲料饲养，最后1次注射结束后，禁食24 h，腹腔注射1～2 mL/kg戊巴比妥麻醉小鼠，取各组心脏组织标本。

1.2.2 HE染色观察心肌形态学变化：按常规HE染色方法操作，镜下观察心肌形态改变，拍照。

1.2.3 Masson染色观察心肌纤维化程度：按常规Masson染色方法操作，并计算胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)，分析心肌的纤维化程度。

1.2.4 ELISA检测心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达：收集各组心肌组织，用预冷的PBS冲洗组织后，称重，将组织剪碎。在剪碎的组织与对应体积的PBS中并加入蛋白酶抑制剂，进行组织匀浆，匀浆液反复冻融放置1周后，5 000×g，离心10 min，取上清检测。根据ELISA试剂盒说明书按步骤进行操作。

1.2.5 Western blot检测心肌组织中c-SKI、α-SMA、CD31、vimentin的表达：使用组织剪，将各组心脏组织的90%～95%剪碎，按照比例加入RIPA裂解液，用超声破碎仪裂解2 min后，静置30 min，12 000 r/min，离心约10 min，取上清。按BCA蛋白定量法进行蛋白定量。上样(上样量为30～40 μg)进行SDS-PAGE，转PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭60 min，然后分别使用c-SKI、α-SMA、CD31、vimentin和GAPDH特异性一抗(1∶1 000)，Snail、Twist和Slug特异性一抗(1∶2 000)，4 ℃ 孵育过夜。漂洗后加入相应的二抗(1∶5 000)一起温育2 h，TBST洗膜3次，用ECL发光试剂盒显色，Bio-Rad成像系统拍照，ImageLab 6.0软件分析。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 c-SKI在小鼠心肌组织中的表达

c-SKI的表达随着模型制备的时间呈下降趋势，7 d时c-SKI的表达即出现下降(P<0.05)，30 d时下降最为显著(P<0.01)(图1)。

2.2 慢病毒感染后小鼠心肌组织中c-SKI的表达

在LV-SKI感染24 h后，c-SKI的表达开始上升(P<0.05)，72 h时c-SKI的表达达到高峰(P<0.01)，至96 h时c-SKI的表达水平出现下降趋势。因此，为了保证实验效果，实验期间每隔3 d注射1次慢病毒以维持有效的作用(图2)。

2.3 c-SKI对小鼠心肌组织形态变化及纤维化程度的影响

与对照组相比，model组可见心肌细胞排列紊乱，结构不清晰，间隙增大，心肌细胞间质显著增多，过表达c-SKI后，与LV-NC组相比，可见部分心肌细胞恢复整齐，形态大小趋于正常，纤维化结缔组织有所减少(图3A)。与对照组相比，model组可见正常的心肌组织结构基本消失，深蓝色的胶原纤维显著增多，过表达c-SKI后，与LV-NC组相比，可见结构趋于整齐，心肌间质胶原纤维有所减少(图3B)。胶原容积分数比较，LV-SKI组比LV-NC组(25.71%±2.28%比33.61%±2.61%，P<0.05)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with 0 day group图1 c-SKI在小鼠心肌组织中的表达随ISO注射时间下降Fig 1 Expression of c-SKI decreased in the myocardial tissues of mouse after injecting ISO

*P<0.05,**P<0.01 compared with 0 hour group图2 c-SKI在慢病毒感染后小鼠心肌组织中的表达Fig 2 Expression of c-SKI in the myocardial tissues of mouse after LV-SKI

2.4 c-SKI对小鼠心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量的影响

与对照组比，model组小鼠心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量均升高(P<0.01)。过表达c-SKI后，与LV-NC组相比，LV-SKI组小鼠心肌组织中可见Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量均有所降低(P<0.01)(图4)。

2.5 c-SKI对小鼠心肌组织中End-MT标志物的影响

与对照组组比，model组小鼠心肌组织中vimentin、α-SMA的蛋白表达上调，CD31蛋白表达下调(P<0.05)。过表达c-SKI后，与LV-NC组相比，LV-SKI组小鼠心肌组织中可见vimentin、α-SMA蛋白表达下调，而CD31蛋白表达上调(P<0.05)(图5)。

A.cardiac pathological changes of mouse observed by HE staining;B cardiac pathological changes of mouse observed by Masson staining图3 HE和Masson染色观察小鼠心肌组织的形态变化Fig 3 Cardiac pathological changes of mouse observed by HE and Masson staining(×400)

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;#P<0.01 compared with LV-NC group图4 小鼠心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白含量Fig 4 Levels of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ in the myocardial tissues of

2.6 c-SKI对小鼠心肌组织中End-MT相关转录因子的影响

与对照组比，model组小鼠心肌组织中Snail、Twist及Slug蛋白表达均上调(P<0.01)。过表达c-SKI后，与LV-NC组相比，LV-SKI组中Snail、Twist及Slug蛋白表达有所下调(P<0.01)(图6)。

3 讨论

内皮细胞向间充质细胞的转化(End-MT)是心肌纤维化的重要形成机制，是一种复杂综合的病理过程，许多研究均已证明抑制End-MT可抑制纤维化进程[5]。最新研究发现改善线粒体的蛋白反应可以抑制End-MT，从而抑制心肌纤维化[6]，也可通过调节End-MT改善糖尿病小鼠的心脏纤维化[7]。本实验结果显示，模型组小鼠心肌组织发生End-MT并促进了心肌纤维化的发展，过表达c-SKI可负向调控End-MT抑制小鼠心肌纤维化。因此，对于End-MT相关分子和调控通路的识别，可能具有靶向治疗心血管疾病的新前景。

*P<0.01 compared with control group;#P<0.05,##P<0.01 compared with LV-NC group图5 Western blot检测vimentin、α-SMA及CD31的表达Fig 5 Western blot analysis of vimentin,α-SMA and CD31 in the myocardial tissues of mice

原癌基因c-SKI属于SKI家族成员，通过抑制Smad2/3磷酸化、阻碍磷酸化Smad3与Smad4结合或募集大量辅抑制子等多种途径，阻断TGF-β/Smad通路对下游靶基因的转录调控[8]。本研究在小鼠心肌纤维化模型中观察内源性c-SKI表达变化，结果发在模型制备过程中c-SKI的表达呈时间依赖性下降，提示c-SKI表达的下调参与了心肌纤维化的进程。c-SKI可以通过抑制锌脂蛋白2(Zeb2)上调同源盒基因蛋白(Mexo2)表达调节心肌纤维化进程[9]，还可通过ERK/CREB信号通路抑制成纤维细胞增殖[10]，而直接沉默c-SKI可增强TGF-β1诱导的心肌细胞上皮间质转化(EMT)，促进心肌纤维化[11]。在犬心房颤模型中心房组织c-SKI的表达下调，与本实验结果相似，过表达c-SKI可减少心房颤动的发作和持续时间，改善心房重构[12]。前期研究表明过表达c-SKI可显著抑制成纤维细胞的增殖和转分化、抑制胞外基质的合成[13]，也可抑制End-MT[14]，从而抑制心肌纤维化。本研究建立心肌纤维化动物模型，进一步证实了c-SKI可以通过抑制EMT发挥改善心肌纤维化的作用。由此可见，c-SKI在心肌纤维化中的重要作用，其有可能成为心肌纤维化治疗的新靶点。

综上，本研究证实过表达c-SKI可以减轻小鼠心肌中纤维组织增生，抑制End-MT的转化改善心肌纤维化。研究还存在一定的不足局限性：首先，c-SKI影响的信号通路，除外经典的TGF-β/Smad以外，其他通路的相关机制尚未阐明。其次，除了调节End-MT外，c-SKI是否还作用于其他靶点发挥抗心肌纤维化作用。总之，本研究为心肌纤维化的研究提供了理论基础。