Lnc-MALAT1减轻miR-217抑制LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞炎性反应

罗传皊，孙利平，戚成栋 *

(枣庄矿业集团中心医院 1.重症医学科；2.小儿内科，山东 枣庄 277100)

肺部的很多疾病都是与肺部的炎性反应密切相关，尤其是脓毒血症肺损伤[1-2]。近期有报道称，非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)能够调控脓毒血症肺损伤的肺泡巨噬细胞炎性小体的释放[3]。长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)转移相关肺腺癌转录本1 (metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)，又称核富集丰富转录本2 (nuclear enrichment enriched transcripts 2，NEAT2)，是一种高度保守的非编码RNA (non-coding RNA，ncRNA)，被认为是肺癌转移和进展的预后生物标志物[4-5]。已有研究报道，lnc-MALAT1(lncRNA-MALAT1)被认为是肺部炎性损伤的重要预后因素[6]。本研究旨在探究lnc-MALAT1调控LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎性反应的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠肺泡巨噬细胞系(alveolar macrophages,AMOs)(ATCC公司)；F12K培养基(Invitrogen公司)；胎牛血清(杭州四季青生物技术公司)；人白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)检测试剂盒、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)检测试剂盒、双荧光素酶报告实验试剂盒(上海碧云天生物公司)；RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation，RIP)实验试剂盒(广州伯信生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养及分组处理：用F12K培养基培养(20%胎牛血清+1%青链霉素)在37 ℃、95% O2、5% CO2的条件下培养、传代NR8383细胞。将正常培养的AMOs随机分为对照组(正常培养细胞)、LPS组(1 mg/L的LPS处理12 h)，下列各组转染后均进行1 mg/L的LPS处理12 h，pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-MALAT1组(转染pcDNA-MALAT1)、miR-NC组(转染miR-NC)、miR-217组(转染miR-217 mimics)、pcDNA-MALAT1+miR-NC组(共转染pcDNA-MALAT1和miR-NC)、pcDNA-MALAT1+miR-217组(共转染pcDNA-MALAT1和miR-217 mimics)。

1.2.2 ELISA实验检测炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的含量：收集待检测细胞的上清液，按照人白介素1β(IL-1β)检测试剂盒、肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒的说明书要求检测其中IL-1β、TNF-α的含量。

1.2.3 RT-qPCR实验检测MALAT1、miR-217的表达量：用RNA提取试剂盒提取需要检测的细胞中的总RNA，再将其反转录为cDNA。按照RT-qPCR试剂盒的要求检测cDNA中MALAT1、miR-217的表达，结果以GAPDH、U6为内参，2-△△Ct法计算MALAT1、miR-217的表达。所用引物序列为：MALAT1，上游引物5′-GGGGGAGTTTTCAGTATTTTTTTTTG-3′，下游引物5′-TACACCTTGAGTCATTTGCCTTTAGG-3′；GAPDH，上游引物5′-GGGAAACTGCGGCGTGAT-3′，下游引物5′-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3′；miR-217，上游引物5′-CGCTCTACTGCATCAGGAACTGA-3′，下游引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6，上游引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.2.4 双荧光素酶报告实验检测miR-217与MALAT1的靶向关系:生物信息学在线预测网站starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)预测MALAT1潜在的靶标。根据预测到的miR-217与MALAT1之间的结合位点，设计含有结合位点的片段(WT-MALAT1)和不含结合位点的片段(MUT-MALAT1)，送由上海吉玛公司完成。将其克隆至荧光载体psiCHECK2，构建荧光素酶报告基因。再将miR-NC、miR-217分别与其转染至AMOs。按双荧光报告基因试剂盒要求操作，检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，用萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性表示细胞的荧光活性。

1.2.5 RIP实验检测miR-217与MALAT1的靶向关系:首先将miR-NC、miR-217转染至细胞，然后按照RIP试剂盒使用说明书要求操作，加入裂解液，作为样本。向含磁珠1.5 mL离心管中加入样本、RNase抑制剂、DNase、IgG抗体或Ago2抗体，4 ℃反应过夜。次日用RIP清洗液充分洗涤，再用DEPC水纯化RNA。提取其中总RNA含量，RT-qPCR检测其中MALAT1的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 Lnc-MALAT1、miR-217在LPS诱导AMOs中的表达

与对照组相比，LPS组细胞中IL-1β、TNFα的含量均显著升高，MALAT1表达显著升高，miR-217表达显著降低(P<0.05)(图1)。

2.2 过表达MALAT1对LPS诱导的AMOs炎性反应的影响

与pcDNA组相比，pcDNA-MALAT1组细胞中MALAT1表达显著升高，IL-1β、TNFα的含量均显著升高(P<0.05)(图2)。

2.3 过表达miR-217对LPS诱导的AMOs炎性反应的影响

与miR-NC组相比，miR-217组细胞中miR-217表达显著升高，IL-1β、TNFα的含量均显著降低(P<0.05)(图3)。

*P<0.05 compared with control group图1 LPS诱导的AMOs中MALAT1、miR-217的表达Fig 1 LPS-induced expression of MALAT1 and miR-217 in alveolar n=9)

*P<0.05 compared with the pcDNA group图2 过表达MALAT1对LPS诱导AMOs炎性反应的作用Fig 2 Over-expressing MALAT1 affected LPS-inducedin flammatory response in n=9)

*P<0.05 compared with the miR-NC group图3 过表达miR-217对LPS诱导AMOs炎性反应Fig 3 Over-expressing miR-217 affected LPS-induced inflammatory response in n=9)

2.4 过表达miR-217对MALAT1调控LPS诱导的AMOs炎性反应的调控

与pcDNA-MALAT1+miR-NC组相比，pcDNA-MALAT1+miR-217组细胞中MALAT1表达明显降低，IL-1β、TNFα的含量也均发生下降(P<0.05)(图4)。

*P<0.05 compared with the pcDNA-MALAT1+miR-NC group图4 LPS诱导的AMOs炎性反应Fig LPS-induced AMOs inflammatory response

2.5 MALAT1靶向miR-217

通过在线预测网站starbase(http://starbase.sysu.edu.cn)预测到MALAT1与miR-217之间存在连续的7个互补的结合位点(图5)。与miR-NC组相比，miR-217组WT-MALAT1细胞的荧光活性显著降低。与miR-NC组相比，miR-217组Ago2 RIP显示细胞的MALAT1表达显著升高(P<0.05)。

RIP.RNA binding protein immunoprecipitation;A.complementary nucleotide sequence;B.dual luciferase experiment result;C.RIP experiment result;*P<0.05 compared with the miR-NC group图5 MALAT1靶向调控miR-217Fig 5 MALAT1 targeted and regulated miR-217

3 讨论

肺泡巨噬细胞是肺部的重要先天免疫细胞[7]。内质网应激可通过增强肺泡巨噬细胞自噬减轻肺部的炎性损伤[8]。MALAT1敲低通过抑制LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞MH-S和小鼠肺泡上皮细胞MLE-12的炎性反应在LPS诱导的急性肺损伤(acute lung injury，ALI)大鼠模型中起保护作用[9]。MALAT1敲低能够减弱LPS诱导的M1巨噬细胞激活，增强IL-4诱导的M2分化以及巨噬细胞纤维化表型[10]。低表达MALAT1可以通过p300介导的IL-8下调，抑制中性粒细胞的趋化性，从而改善肺移植缺血-再灌注炎性损伤[11]。本研究结果显示，MALAT1在LPS诱导的AMOs中的表达异常升高，并且MALAT1明显上调致炎因子IL-1β、TNFα的含量，这与报道的实验结果相一致，与Dai的实验结果相悖。深入研究发现，MALAT1与miR-217之间存在靶向关系，并通过双荧光素酶报告实验和RIP实验进行了验证，提示miR-217可能也参与了MALAT1对肺泡巨噬细胞炎性因子分泌的调控作用。

miR-217作为miRNAs的一种，在炎性反应和纤维化中发挥重要作用[12]。miR-217在高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞中通过Sirt1/HIF-1α信号通路促进炎性反应和纤维化，参与糖尿病肾病的发展过程[13]；miR-217在间质性肺炎患者的肺泡巨噬细胞和血清中的表达异常下降[14]。本研究发现，miR-217在LPS诱导的AMOs中的表达发生下调，而过表达miR-217能够抑制LPS诱导的AMOs IL-1β、TNFα的分泌，这暗示miR-217具有潜在的抗感染价值。进一步研究还发现，过表达miR-217还可部分逆转过表达MALAT1对LPS诱导的AMOs IL-1β、TNFα分泌的促进作用。不足之处为这些实验结果仅在体外得到了初步验证，仍需进一步在动物体内进行更充分的验证。

综上所述，lnc-MALAT1在LPS诱导的肺泡巨噬细胞中表达上调，其可促进炎性反应，作用机制为靶向抑制miR-217，为肺部损伤的治疗提供新靶标。