养阴润肠方调控水通道蛋白改善慢传输型便秘的疗效及机制研究*

卜贺启 蔡 珂 吴 霜 沈 锋

浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

便秘的患病率受多种要素的影响，一般社会人群中便秘患病率约为20%。其中有15%～42%功能性便秘的患者存在慢传输型便秘（STC），且与粪便缓慢输送有关[1]。尽管目前对于STC的病理机制有了一定研究，但具体的发病机制仍不完全清楚。近年来研究发现，水通道蛋白（AQPs）在水体转运系统中发挥重要作用，其表达异常也是一个与便秘相关的病理机制。AQPs具有水和甘油选择性转运的功能，遍及于消化系统的各个组织和器官中，其中AQP-1、2、3、4、5、7、8、9、10、12广泛分布于肠道上，并且参与肠道疾病的发生发展。研究已证实中医药治疗STC，不仅可改善便秘临床症状，还可调理胃肠道性能，改善患者的生活质量。为此，我们探讨养阴润肠方对STC的治疗效果及作用机制，为其临床的进一步推广提供依据。

1 资料和方法

1.1 材料：RNA试剂盒（DP419，TIANGEN公司）；cDNA反转录试剂盒（K1633，PeproTech公司）；qPCR试剂Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（RK21203，Sigma公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（P0015S，Sigma公司）；AQP8抗体（ab248604，ABclonal公司）；AQP3抗体（ab153694，ABclona公司）；HRP标记二抗（ab9482，AB-clonal公司）；其他试剂（abcam公司）。

1.2 临床资料：选取我院2016年6月～2018年6月期间门诊和住院部确诊的符合相关标准的STC患者80例，随机分为观察组和对照组，每组40例，年龄在18～65岁，病程在0.5～10年。观察组男17例，女23例；平均年龄48.3±3.2岁；平均病程5.6±1.2年。对照组男19例，女21例；平均年龄45.2±0.4岁；平均病程5.1±0.9年。两组患者在性别、年龄、病程等方面之间的统计结果无明显差异（P＞0.05），具有可比性。诊断标准：西医、中医诊断分别参考《罗马Ⅳ：功能性胃肠疾病国际标准》[2]和《中医病证诊断疗效标准》[3]。纳入标准：①符合罗马Ⅳ便秘诊断标准中STC诊断；②结肠传输试验、排粪造影等检查证实者；③18～65周岁，男女不限；④签署知情同意书；⑤中医辨证为阴虚肠燥证者。排除标准：①服从性差，不按规定用药者；②便秘因消化道器质病变致肠腔梗阻等特异性疾病所致；③既往有泻药史、腹部或结肠切除术史；④中药汤剂过敏者、妊娠期、哺乳期妇女；⑤合并有基础疾病，如糖尿病、心脏疾病、免疫缺陷，消化系统和造血系统等严重原发疾病以及精神疾病患者。

1.3 治疗方法：观察组予以养阴润肠方：生白术30g，炙升麻、炒枳壳、六神曲各15g，玄参、生地、生麦冬、郁李仁、火麻仁、瓜蒌仁各20g。水煎服，为避免患者各自煎煮的差异，由我院中药房统一煎煮成袋装发放，每日2次，每次1包。本方获得浙江省中医药研究院伦理委员会批准，标准号：XMSC2016026。对照组予以聚乙二醇散剂，即福松（博福，进注号H20110130）口服，每日2次，每次2包（20g）。两组均治疗3个疗程，每个疗程7天。

1.4 评价指标：①一般观察指标：观察组和对照组分别及时记录治疗前后患者生活质量自评表（PAC-QOL）及慢性便秘严重程度评分表（CCS），以及伴随的其他临床症状（包括头晕目眩、口干咽干、干咳、目干、腰酸耳鸣健忘、尿少尿黄、手足心热、大便干燥、睡眠差）等（备注：次要症状有为1分；无为0分）。②安全性评价指标：治疗前后均检测血常规、尿常规、大便常规、肝脏肾脏功能、凝血功能、心电图，胸片。③随访：对治愈患者进行停药后2个月的随访，评估其效果。

1.5 疗效评估：参照《中医病证诊断疗效标准》中便秘的疗效标准[4]。治愈：2天内可有排便1次及以上，便质变成润泽，大便通畅，伴随症状消失，短期内无复发；显效：2天内可有排便，便质变得干结或接近正常，排便不平滑，伴随症状大部分缓解或消失；有效：3天内有排便，便质变得松软或先干结后软，排便不平滑，伴随症状部分缓解或消失；无效：症状无改善。

1.6 Western Blot检测：按照说明提取患者结肠黏膜总蛋白，在RIPA裂解缓冲液中溶解和匀浆。BCA蛋白检测试剂盒测定最终蛋白浓度，从每个样品中提取等量总蛋白（40μg/每通道），用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉进行封闭2h，洗膜后加入相应抗 AQP3、AQP8、GAPDH抗体（均1∶1000稀释）4℃过夜，洗膜3次，然后加入辣根过氧化物酶偶联二抗（1∶1000）室温下孵2h。用增强型化学发光（ECL）检测系统和成像系统检测。

1.7 荧光定量PCR：用TRIzol试剂提取组织中RNA，分光光度法对其纯度进行测定，然后按照逆转录试剂盒操作说明合成cDNA。以GAPDH为内参，将含有SYBR Green的反应液在PCR检测系统上进行扩增。反应条件为：95℃，3min（预变性）→95℃，10s→60℃，30s→72℃，30s下进行40个循环，最后在72℃延长10min。反应结束后立即绘制溶解曲线，SYBR Green检测荧光改变，2-ΔΔCt方法进行数据分析。引物序列如下：

其中AQP3引物大小为708bp，AQP8引物大小为556bp，GAPDH引物大小为482bp。

1.8 统计学分析：实验数据用均数±标准差表示，采用SPSS 18.0统计软件。t检验和单因素方差分析进行两组和多组间的比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组治疗对CCS便秘评分、PAC-QOL评分以及伴随次要症状的影响：治疗前两组患者的CCS便秘评分、PAC-QOL评分以及伴随次要症状无明显差异（P＞0.05）；治疗后两组患者的CCS便秘评分、PAC-QOL评分以及伴随的次要症状较治疗前相比较均有所下降，但观察组的各项评分均低于对照组（P＜0.05），见表1、表2。

表1 两组治疗前后PAC-QOL评分、CCS便秘评分比较（±s，分）

表1 两组治疗前后PAC-QOL评分、CCS便秘评分比较（±s，分）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

CCS便秘评分11.17±5.74 5.60±4.68*10.05±5.14 7.60±4.68组别 例数观察组40对照组40时间治疗前治疗后治疗前治疗后PAC-QOL评分79.48±20.45 62.02±14.83*78.23±18.63 70.02±16.72

表2 两组治疗前后伴随次要症状情况比较（±s，分）

表2 两组治疗前后伴随次要症状情况比较（±s，分）

注：与对照组比较，*P＜0.05。

组别观察组（40例）对照组（40例）时间治疗前治疗后治疗前治疗后头晕目眩0.19±0.39 0.07±0.20*0.20±0.25 0.10±0.30口干咽干0.22±0.41 0.05±0.21*0.21±0.54 0.08±0.26干咳0.13±0.34 0.04±0.26*0.14±0.63 0.05±0.22目干0.15±0.36 0.06±0.18*0.16±0.63 0.08±0.28腰酸耳鸣健忘0.22±0.41 0.14±0.27*0.21±0.14 0.16±0.37尿少尿黄0.14±0.35 0.03±0.13*0.13±0.55 0.04±0.19手足心热0.11±0.31 0.05±0.25*0.12±0.41 0.07±0.25大便干燥0.33±0.47 0.07±0.27*0.34±0.56 0.13±0.34睡眠差0.18±0.39 0.08±0.24*0.20±0.47 0.11±0.32

2.2 两组临床疗效情况：治疗后，观察组治愈17例，显效12例，有效6例，无效5例，总有效率87.5%；对照组治愈8例，显效10例，有效13例，无效9例，总有效率77.5%。两组总有效率比较，有显著性差异（P＜0.05）。

2.3 两组安全评估情况：治疗前后两组患者血常规、尿常规、大便常规、肝肾功能、凝血功能、心电图、胸片均未见明显变化（P＞0.05）。

2.4 两组治疗后复发率情况：停药2月后，观察组治愈17例，复发3例（17.65%）；对照组治愈8例，复发4例（50.00%）。观察组复发率低于对照组（P＜0.05），短期疗效优于对照组。

2.5 AQP3和AQP8在两组的基因表达情况：相对于治疗前，两组治疗后AQP3和AQP8基因表达量均增加（P＜0.05）；但观察组治疗后AQP3和AQP8基因表达量上升显著（P＜0.01）。见图1。

图1 QPCR检测两组AQP3、AQP8的水平变化

2.6 AQP3和AQP8在两组的蛋白表达情况：相对于治疗前，两组治疗后AQP3和AQP8蛋白表达量均增加（P＜0.05）；但观察组治疗后AQP3和AQP8蛋白表达量与基因表达量上升显著（P＜0.01）。见图2。

图2 两组AQP3、AQP8蛋白电泳图及灰度值统计图

3 讨论

STC是慢性功能性便秘患者中很普遍的一种类型，在人群中占相当大的比例，其治愈率较低，临床症状顽固，病情时常反复，少数患者最终需要手术干预。中医学认为，STC患者多因久服泻剂导致大肠蠕动功能降低，加上火燥、风寒等病理因素引起排便困难。其主要病机为阴血亏虚，运行无力，肠燥失濡而致大便秘结，治疗上主要以养阴润肠通便为主。本研究应用养阴润肠方的配伍原则参照养阴润肠方用药分析[5]。验方10味中药，有3味养阴药（玄参、麦冬、生地黄），3味润肠药（火麻仁、郁李仁、瓜蒌仁），占到全方60%。其他用药，如生白术、升麻、枳壳等，都是治疗便秘的经典特色用药。整个组方可以起到养阴润肠通便的功效，与西药治疗相比较，明显减少了泻下猛攻药物的用量，对肠道刺激作用小，药效温和，可因人而异，对症下药。本研究表明，养阴润肠方较福松能明显降低患者的PAC-QOL评分、CCS便秘评分以及伴随的次要症状，能改善患者的便秘症状及短期复发率。

目前的研究表明，水通道蛋白与STC的发生可能有关，为STC的发病机制提供了新的研究方向。至少有13种AQP亚型（AQP0～12）在哺乳动物中被发现，其中研究已证实AQP3、AQP8与结肠的水转运密切相关[6]。通过进一步检测观察组与对照组标本中AQP3、AQP8基因与蛋白的变化，笔者发现观察组与对照组治疗后AQP3、AQP8基因与蛋白表达较治疗前明显增加，这与之前的报道相符[7]。提示AQP3、AQP8的改变可能与STC的改善有一定关联。

本研究结果表明，养阴润肠方能促进排便，显著缓解功能性便秘人群的便秘症状，改善便秘人群的生活质量，其可能的机制与水通道蛋白AQP3、AQP8的表达上调有关。此研究为开发中药靶点药物开启道路，但其临床研究的远期效果及进一步推广有待大样本的研究支撑。