4 种检测方法对结核病的诊断价值

兰小英，卢榕（通信作者），练明建

厦门大学附属第一医院检验科·厦门市基因检测重点实验室 （福建厦门 361003）

结核病为结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所引起的慢性传染性疾病，位列全球十大死因之中，同时也是单一传染病中的“头号杀手”[1]。据《全球结核病报告》显示，2018年约有1 000万新发结核病患者，其中57%为成年男性，我国的结核病发病率居世界第二[2]。人体感染MTB初期，无明显临床表现，当机体免疫力低下或变态反应增高时会发展为活动性结核病，给患者及其家属身心带来严重伤害[3]。因此，早期诊断并及时有效治疗结核病是降低我国结核病发病率的关键[4]。目前，如何快速、准确诊断结核病成了研究的热点。本研究将比较结核菌素（purified protein derivative，PPD）试验、结核感染T细胞斑点试验（T-cell spot test for tuberculosis infection，T-SPOT.TB）、结核分枝杆菌抗体（mycobacterium tuberculosis antibody，TB-Ab）检测和抗酸染色涂片（acid-fast smear，AFS）4种检测方法对结核病诊断的临床价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年6月至2019年12月我院收治的326例患者为研究对象，其中结核病患者198例，非结核病患者128例。本研究获医院医学伦理委员会审批，经患者知情同意并签署知情同意书。所有确诊结核病患者均根据既往病史、临床症状和体征、影像学检查及抗结核治疗有效而确诊，结核感染确诊根据我国卫生行业标准（WS 196-2017）[5]。

1.2 方法

PPD试验：于左前臂掌侧前1/3无瘢痕处皮内注射5 IU PPD，经72 h（48～96 h）测量皮肤硬结直径。判读标准：阴性（-），硬结平均直径＜5 mm或无反应；弱阳性（+），5 mm≤硬结平均直径＜10 mm；中度阳性（2+），10 mm≤硬结平均直径＜15 mm；强阳性（3+），硬结平均直径≥15 mm或局部出现剧烈红肿、双圈、水泡、组织坏死及淋巴管炎。

T-SPOT.TB：按照T-SPOT.TB试剂盒说明书操作，该实验采用免疫印迹的方法，将采集好的5 ml肝素抗凝外周静脉血，采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs），洗涤，记数PBMCs；然后分别将50 μl阴性对照细胞培养液、阳性对照植物血凝素、A抗原早期分泌性靶抗原6（6 kDa early secretary antigenic target，ESAT-6）及B抗原滤液培养蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）加入已包被有抗干扰素-γ（interferongamma，IFN-γ）抗体的微量板4个孔中，每孔再加入100 μl PBMCs，同时置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育16～20 h；磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PBS） 洗涤，再加入50 μl底物工作液37 ℃孵育2～3 h，采用斑点计数仪自动计数斑点数。判断标准：要求阴性对照孔斑点数≤5个，阳性对照孔斑点数≥20个，当检测孔斑点数-阴性对照孔斑点数≥5个时，结果判定为阳性。

TB-Ab 检测：按标准操作规程将质控品和检测试剂预先平衡至室温，在质控孔和检测孔上依次加入封闭液、40 μl 新鲜的血清、6滴洗涤液、2滴金标液、6滴洗涤液，每次滴入后等待薄膜吸入，最后观察结果。判断标准：阴性，质控点显示红色，反应孔中间无红色斑点或仅为痕迹；阳性，质控点显示红色，反应孔中间有红色斑点出现。

AFS：按照涂片、固定、抗酸染色的步骤制作玻片，显微镜下观察结果，抗酸杆菌具有耐受酸性介质脱色的生物特性，石碳酸（苯酚）和复红将抗酸杆菌染色后，加入3%盐酸乙醇脱色，标本中的非抗酸菌及其他脱落细胞被复染剂亚甲蓝染为蓝色，抗酸杆菌在显微镜下保持红色。判断标准：抗酸杆菌阴性，连续观察300个不同视野，未发现抗酸杆菌；抗酸杆菌阳性（1+），3～9条/100视野，连续观察300个视野；（2+），1～9条/10视野，连续观察100个视野；（3+），1～9条/1视野；（4+），≥10条/1视野。

1.3 评价指标

比较PPD 试验、T-SPOT.TB、TB-Ab 检测和AFS 4种检测方法的灵敏度和特异度，灵敏度=结核病患者阳性例数/结核病患者总例数×100%，特异度=非结核病患者阴性例数/非结核病患者总例数×100%。

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行数据处理，计数资料以率表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

T-SPOT.TB 与其他3种检测方法相比，灵敏度最高，特异度最低；AFS 与其他3种检测方法相比，特异度最高，灵敏度最低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 4种检测方法在结核病患者和非结核病患者中的灵敏度、特异度比较

3 讨论

结核病是严重危害人类健康的传染性疾病，近年来，随着环境污染的加剧和艾滋病的传播，结核病的发病率呈明显升高趋势，且高耐药性结核病患者的数量不断增加，对潜伏性结核病患者的早期诊断和及时治疗成为控制结核病的重要措施。AFS 具有操作简单快捷、价格低廉等优势，在实际工作中运用广泛。Lee 等[6]研究结果显示，在活动性肺结核病诊断中，AFS 的特异度高达100.00%。本研究结果显示，AFS 与其他3种检测方法相比，特异度最高，与上述研究结果相似。但是，AFS 的灵敏度较低，易漏诊，这可能与部分患者留痰困难、标本留取不合格有关。

PPD 试验以MTB 纯蛋白衍生物为抗原，在左前臂掌侧前1/3中央皮内注射， 48～72 h 后注射部位会出现皮肤硬结，根据硬结的平均直径来判断结果，价格低廉、操作简单方便，被广泛应用于临床。本研究结果显示，PPD 试验的灵敏度为54.55%，特异度为78.13%，其他3种检测方法相比，结果较为居中，可以作为潜伏性感染者的筛查方法。需要注意的是，将其应用于免疫抑制剂、免疫力低下的患者中，可能出现PPD 试验假阴性，从而降低灵敏度[7]；此外，卡介苗的普遍接种会导致假阳性的发生，同时人工记录结果的方式也会影响判断的客观性[8]。

T-SPOT.TB 是近年来运用较为广泛的检测结核病的方法，也是一种新兴的酶联免疫斑点试验，基本原理是将PBMCs 与抗原置于反应孔中进行特异抗体反应，刺激所有的致敏T 细胞；致敏T 细胞分泌的IFN-γ 被预包被在反应孔膜上的特异抗体捕获，经过洗涤、标记二抗，碱性磷酸酶与细胞因子上不同的抗原决定簇结合；通过洗涤去除无任何标记的抗体；可溶的底物溶液加入每个检测孔中，在反应部位被酶分解形成不溶性色素沉淀斑点，1个斑点代表1个分泌细胞因子的T 细胞，记数斑点数量可以获得外周血中被结核致敏的T 细胞数量。卡介苗菌株和大部分非结核分枝杆菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）缺少或丢失与T-SPOT.TB 相同的抗原，因此该试验不受卡介苗和大部分环境分枝杆菌影响[9-10]，卡介苗导致的假阳性基本可以排除[11]。查阅国内外相关文献，多篇文献评估了T-SPOT.TB 在活动性结核病特别是痰涂片阴性结核病中的诊断价值，报道的T-SPOT.TB 总体灵敏度和总体特异度分别为80%和79%，高于PPD 试验的65%和75%[12-13]。本研究结果显示，T-SPOT.TB 与其他3种检测方法相比，灵敏度最高，特异度最低，说明T-SPOT.TB 在诊断结核病方面具有较高的价值。有研究表明，T-SPOT.TB 在潜伏性感染患者中有较高的预测价值，如果为阴性则可以排除活动性结核病[14]。需要注意的是，T-SPOT.TB 测定针对MTB 特异的效应T 淋巴细胞，在感染早期及少数免疫系统功能不全等基础疾病患者中，如艾滋病感染者、肿瘤患者、婴幼儿等都会引起假阴性的发生，从而降低灵敏度[15]。

TB-Ab 检测采用纯化的MTB 特异性外膜抗原，利用斑点免疫金渗滤试验（dot-immunogold filtration assay，DIGFA）原理，检测血清中的MTB 抗体，用于结核病的辅助诊断。本研究结果显示，TB-Ab 检测的灵敏度为12.24%（较低），特异度为92.19%（较高），说明TB-Ab 检测可以作为一种初筛试验，为结核病的诊断提供参考，其阳性结果表明有MTB感染的可能，或近期有结核病患者的密切接触史。

在结核病高负担国家中，潜伏性感染者有5%～10%的可能性发展成为活动性结核病，并成为新的传染源，造成结核病的进一步传播，WHO 指出，全球仅有37%的结核病患者被确诊，发达国家也仅有50%的结核病患者被确诊[16]。因此，对潜伏性感染者的有效筛查及结核病的有效防治是控制结核病的根本。T-SPOT.TB 的灵敏度较高，且受机体免疫状态的影响较小，对结核病的诊断具有较高价值，同时标本获取方便，只需1管外周血，2 d 快速诊断，但是特异度低，不能作为单独或决定性的结核病确诊依据，需结合患者的年龄、免疫情况、患病状态等进行综合评估，同时操作相对复杂，需要较高的实验技术和实验条件，价格相对昂贵，在我国基层广泛开展和推进具有一定的难度。因此，研究新的抗原、开发新的分子诊断标记将是T-SPOT.TB 未来研究的方向[17]。目前，结核病的确诊需结合其他检测方法、临床表现及影像学检测，提高灵敏度和特异度，共同作为诊断结核病的依据。

综 上 所 述， T-SPOT.TB 与PPD 试 验、TB-Ab 检 测 和AFS 比较，具有简便、快速、灵敏度高等优点，是临床快速诊断结核病的有效检测方法，但由于特异度较低，需要与其他方法联合检测，以提高早期诊断结核病的价值。