中药干预骨质疏松症细胞自噬的研究进展

马涛 张晓刚* 赵永利 于海洋 曹盼举 赵希云 张宏伟 权祯 陈钵

1.甘肃中医药大学中医临床学院，甘肃 兰州 730000

2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730000

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种慢性代谢性疾病，其特征在于骨矿物质密度降低和骨组织结构缺陷[1]。OP的发生伴随着骨骼强度的渐进性降低，增加了脆性骨折的风险。随着人口老龄化进程的加快，其发病率不断升高，导致了患者生活质量下降以及高昂的医疗费用支出，已经成为严重危害人类健康的公共卫生问题，因此如何有效防治OP成为亟待解决的难题[2]。近年来研究表明自噬与成骨细胞(osteoblasts，OB)、破骨细胞(osteoclasts，OC)以及骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的增殖分化、功能发挥密切相关，自噬活性的变化对于维持骨稳态至关重要，是OP发病的关键因素。本文拟对中药干预OP细胞自噬的影响及最新进展进行综述。

1 自噬相关概述

细胞自噬(autophagy)是一种高度保守的细胞分解代谢和能量产生过程，通过溶酶体途径回收降解细胞内衰老的细胞器、蛋白质和致病微生物，以实现蛋白质和能量更新代谢并且维持细胞内环境稳态[3]。正常条件下基础自噬在所有细胞中均处于较低水平，是维持体内稳态功能的必需条件，但在缺氧、感染以及氧化应激等因素作用下可能会刺激细胞自噬异常激活[4]。细胞自噬过程主要分为成核、延伸、成熟和降解等4个主要步骤，其中自噬小体的形成为关键环节，该过程被大约35种自噬相关基因(autophagy-related gene, ATG)家族蛋白控制[5]。首先，由Ⅲ类PI3K/Vps34复合物激活后结合ATG14、Vps15、Beclin-1等蛋白形成多蛋白复合体，诱导双层膜结构继续延伸[6]。随后Atg12/Atg5与Atg8/LC3两个进化保守的泛素样结合系统协调完成其延伸和闭合过程，该系统促使LC3-1与磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)偶联至LC3-II，其中LC3-II作为自噬体中存在的完整膜蛋白，被认为是自噬可靠标志物[7]。最后，分离的物质和内部自噬体膜被溶酶体水解酶分解并降解以进行更新[8]。最新研究表明，细胞自噬作为一种细胞存活途径，参与调控BMSCs、OB及OC，在维持骨稳态方面起着至关重要的作用，并且该途径的改变在某种程度上与OP密切相关[9]。

2 自噬与骨质疏松症的相关性

2.1 骨髓间充质干细胞自噬

BMSCs是骨髓中的常驻细胞群，负责成骨、成脂和软骨分化，其自我更新和多向分化潜能的异常是OP的关键病理因素。越来越多的证据表明，BMSCs的干性维持和功能活性取决于自噬与凋亡之间的协调平衡[10]。Liu等[11]发现自噬可以通过拮抗细胞凋亡来抑制ROS诱导的细胞死亡，从而延长BMSCs的寿命，维持其干性。此外，过量使用激素会损害BMSCs的增殖能力，而自噬可以减轻激素对BMSCs增殖的负面影响[12]。另一方面，自噬与BMSCs成骨分化之间存在内在联系。BMSCs被证明在分化未开始时积累自噬体并将其递送至溶酶体，并通过与AMPK/Akt/mTOR信号传导协同刺激BMSCs向OB分化[13]。Wan等[14]发现，与健康人相比，OP患者的BMSCs自噬水平及成骨潜力显著降低。在动物实验中，同样可以观察到OP小鼠模型中BMSCs自噬水平的降低，以及成骨分化和免疫调节的异常[15]。基于此可以看出，自噬活性影响BMSCs的增殖分化、功能活性以及干性维持，并与OP密切相关。然而，目前关于自噬介导BMSCs的成骨分化仍存在争议，有学者认为OB的分化不受自噬药理学或基因失活的影响[16]。因此，需要更充分有力的证据来分析自噬途径及其在BMSCs成骨过程中的作用。

2.2 成骨细胞自噬

OB作为骨形成的调节剂，其重要作用之一是刺激骨基质矿化，发挥骨骼构建的基本功能。研究证实自噬相关基因不仅在BMSCs向OB分化过程中意义重大，而且通过影响OB的正常生理功能以及骨基质的矿化干预OP的发病[17-18]。Weng等[19]研究发现，沉默ATG5可抑制OB的增殖和分化并增加细胞凋亡，过表达ATG5则可增强OB的抗氧化能力并减少细胞凋亡，这表明自噬对维持OB活力及正常增殖、凋亡至关重要。ATG7和Beclin-1是OB谱系中矿化所必需的自噬相关基因，自噬体作为重要的运输载体参与了OB矿化过程。Nollet等[20]发现对ATG7和Beclin-1进行基因沉默后，OB谱系的矿化效率显著下降。Liu等[21]研究发现通过敲除OB中FAK家族相互作用蛋白(FIP200)导致小鼠骨质减少，其原因在于自噬水平的降低导致了OB分化和矿化能力的下降。此外，自噬也积极参与了对成骨具有重要意义的信号通路。例如，胰岛素样生长因子-I(IGF-I)刺激OB的成骨分化，其部分机制是通过激活AMPK信号通路和上调自噬来实现的[22]。此外，骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的促成骨级联反应涉及ATG7的激活，该因子随后靶向调控Wnt16以激活MMP-13并最终促进OB分化[23]。上述研究表明自噬相关基因ATG7、Beclin-1、ATG5 等均介导了OB的骨形成过程。通过明确自噬对OB功能的影响，为探索骨骼病理状况及OP发生机制提供有力的理论支撑。

2.3 破骨细胞自噬

OC是由BMSCs分化以及单核前体细胞融合形成的一类高度分化的多核巨细胞，不仅主导骨吸收过程，而且是机体免疫系统不可替代的组成部分[24]。最新研究表明，自噬在促进破骨前体细胞向OC分化及发挥OC正常生理功能方面扮演重要角色。破骨前体细胞向OC的分化过程由巨噬细胞集落刺激因子(monocyte colony-stimulating factor，M-CSF)和RANKL(receptor activator for nuclear factor-κB ligand)通过信号调节开始，趋化因子CXCL12以及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine- 1- phosphate，S1P)则负责其中OC的粘附和迁移，而S1P被证实可以通过mTOR途径抑制自噬，预示自噬与OC的形成关系密切[25-26]。此外，对于OC主导的骨吸收过程中，ATG5、ATG7、Beclin-1、P62、LC3等自噬相关基因均参与其中。有学者[16]发现通过敲除去卵巢 (ovariectomized，OVX)小鼠中的ATG7，能抑制OC活性并降低骨吸收水平，最终引起骨量丢失。骨吸收的关键在于OC在骨表面的迁移过程，而LC3-II缺乏导致OC不能降解过时的伪足小体，进而导致细胞内肌动蛋白结构的紊乱和OC的迁移受损[27]。另一项关于Beclin-1敲除小鼠的体内外实验，显示出OC的分化障碍以及骨吸收功能的受损[28]。除了维持OC的形成及功能发挥，多项研究证实在糖皮质激素诱导的体外缺氧、微重力、氧化应激等条件下，自噬活性增加有利于减少细胞应激反应，从而保护OC的形成和存活[29-31]。

3 中药干预骨质疏松症细胞自噬

3.1 中药单体

Zheng等[32]在OVX小鼠中分离出BMSCs，发现LC3和Beclin-1的蛋白和mRNA表达均显著降低，表明OVX小鼠的自噬水平下降，进一步应用蛇床子素(osthole，Ost)处理BMSCs，导致LC3和Beclin-1蛋白的上调以及mRNA的产生，认为Ost可以维持BMSCs自噬并促进其成骨分化。同样可以通过增加自噬活性来增强BMSC成骨分化，从而逆转骨量丢失的还有芦丁(rutin，Rut)[33]、淫羊藿苷(icariin，Ica)[34]、欧前胡素(imperatorin，Imp)[35]等。此外，Kim等[36]发现双膦酸盐导致OB活性下降并加速其凋亡，应用高良姜素后则观察到OB自噬水平的提高以及凋亡过程的逆转，提示类黄酮保护OB的活性及功能是通过自噬来实现的。白藜芦醇(resveratrol，Res)、芒果苷(mangiferin，Mag)以及水晶兰苷可以通过促进OB自噬降低氧化应激水平，进而保护OB免受过氧化氢(H2O2)的细胞毒性作用，达到保护OB存活的目的[37-39]。Feng等[40]发现葛根素(puerarin，Pur)可以通过自噬促进OB增殖和分化，但是对其矿化没有显著影响，其可能的分子机制是下调miR-204导致LC3B表达增强。而Pur对OC自噬的诱导作用可能是基于Akt/mTOR通路实现的[41]。山萘酚(kaempferol，Ka)可以通过阻断自噬抑制OC分化和骨吸收[42]。上述研究提示中药单体及其有效成分可干预BMSCs、OB、OC等多种细胞的自噬相关基因表达水平。

3.2 中药复方

近年来，中药复方调控OP细胞自噬的相关实验及临床研究逐渐增加。赵旭等[43]对OP大鼠给予左归丸干预后，从基因组学层面分析BMSCs的基因表达谱时间序列变化，发现左归丸可能通过调控BMSCs、OB及OC的自噬凋亡、增殖分化水平，进而促进OB分化，减弱OC活化，抑制骨吸收并减少骨量丢失，最终达到治疗OP的目的。沈耿杨[44]通过在体及体外实验，运用基因沉默等技术进一步证明了左归丸对BMSCs成骨分化的促进作用，并推测其可能与let-7f以及自噬的相互作用有关。石垚[45]基于网络药理学及动物实验，提出二仙汤可以调控Akt/mTOR通路提高OB自噬水平，提升OB的抗氧化和抗凋亡能力，达到抗衰老性OP的作用。于岩松[46]发现补正续骨丸可以通过调节自噬相关mTOR信号通路中4EBP1、p70S6K蛋白的表达来抑制骨吸收，进而治疗绝经后OP以及骨质疏松性骨折。谭登等[47]将补肾通络方作用于斑马鱼OP模型，发现其不仅可以增加斑马鱼椎骨面积，显著降低CTSK，TRAP表达及肌动蛋白环数目，而且可以抑制ATG5、ATG7、p62等破骨分化标志基因表达。提示补肾通络方可以通过降低自噬来抑制OC增殖分化以及骨吸收进程。

4 小结

自噬参与调控BMSCs、OB以及OC的增殖分化、功能发挥，其活性的降低会影响骨形成与骨吸收之间的动态平衡即骨稳态，以此来作为自噬防治OP的分子层面的作用机制。此外由于OP进程中复杂的骨量丢失机制，我们推测自噬不仅可以干预骨稳态，其与雌激素缺乏、衰老状态、代谢性酸化之间的相互关系同样不容忽视。

目前尚未开发出安全、有效的药物来干预OP复杂进程中的细胞自噬。现阶段，中药干预OP细胞自噬的研究虽具有广阔前景但仍处于探索期，但有研究认为中药对BMSCs、OB以及OC等细胞的自噬水平有不同程度的干预作用，其机制尚未明确。未来应该不断开展以中医药理论指导的临床及实验研究，结合传统中医药以及现代分子生物学技术，深入发掘中医药干预OP细胞自噬的靶向治疗机制，尽可能多的探索可以干预OP细胞自噬的中药单体及有效成分、中药复方以及治疗方法等，以期为中医药防治OP提供新的视角与思路。