CXCL8在宫颈癌组织中的表达水平及临床意义

郑鑫飞，阮俊豪，陈翔艺，张淑芳，叶爱华，王诗颖，刘荣强

福建医科大学附属南平市第一医院放疗科，福建南平 353000

宫颈癌是女性生殖系统肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤，据统计，2018年全球宫颈癌患病人数为57万，病死人数为31.1万，其中约84%的宫颈癌患者来自发展中国家[1]。随着人们生活水平的提高和恶性肿瘤防治理念的逐渐普及，宫颈癌的预防与控制工作初见成效，但仍有较高的发病率[2]。因此，开发比妇科内镜检查、高危型人乳头瘤病毒及宫颈癌液基细胞检测更加有效的早期筛查方法显得尤为重要。目前，宫颈癌治疗手段主要包括手术、化疗及放疗，早期宫颈癌患者经过系统治疗后生存率明显提高，但是对于复发或新发转移性病灶患者治疗手段仍然十分有限。肿瘤基因学是肿瘤研究的基础，对肿瘤的生物学特征及发病机制进行探讨，将有助于在未来开发出更有效的诊断及治疗方法[3]。CXC趋化因子配体8(CXCL8)是由中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、T细胞、上皮细胞和内皮细胞产生的趋化因子[4]。有研究发现，在肿瘤微环境中CXCL8通过自分泌或旁分泌的方式促进肿瘤细胞生长和发挥免疫抑制作用[5]。CXCL8作为一种重要的多功能趋化细胞因子，与多种肿瘤的发生、转移、耐药及预后相关，故本研究拟探讨CXCL8水平与宫颈癌患者临床特征和预后的关系，旨在为临床宫颈癌诊疗提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1数据库研究对象 选取TCGA和GTEx数据库来源的306份宫颈癌组织和13份正常宫颈组织标本，以及有总生存期(OS)资料的宫颈癌患者292例为在线数据分析研究对象。

1.1.2临床研究对象 选取2012年7月至2019年2月本院收治的76例宫颈癌患者，所有患者的宫颈癌组织及癌旁组织标本均经病理活检或手术采集。纳入标准：符合宫颈癌诊断标准[6]，并经组织病理学检查证实；癌旁组织为距肿瘤病灶5 cm以上的组织，经免疫组织化学染色证实；所有患者均为初诊，且参与本研究前未行放疗或化疗。排除标准：年龄>80岁；合并其他较为严重的妇科疾病；合并其他类型恶性肿瘤；合并严重心、肝、肾等重要脏器功能障碍；合并认知障碍及精神疾病；无完整的临床及随访资料。76例宫颈癌患者年龄21～80岁，平均(49.69±13.54)岁；宫颈癌TNM分期：Ⅰ期39例，Ⅱ期17例，Ⅲ期 7 例,Ⅳ期13例；分化程度：低分化52例，中、高分化24例；有远处转移的25例，无远处转移的51例；有淋巴结转移的29 例，无淋巴结转移的47例；有淋巴脉管浸润的47例，无淋巴脉管浸润的29例；浸润深度：T1+T2有62例，T3+T4有14例。所有患者的治疗均参照《2019 NCCN宫颈癌临床实践指南(第1版)》，即Ⅰ～ⅡA期采用手术或放疗，手术方式为根治性子宫切除术、盆腔淋巴结切除术和(或)腹主动脉淋巴结取样术，且当术后有复发高危因素(子宫旁、深间质浸润或淋巴结转移)时需辅助同步放、化疗；ⅡB～ⅣA期采用同步放化疗；ⅣB期以系统支持治疗为主。本研究获得本院医学伦理委员会审核批准，所有患者及其家属均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1在线数据分析 采用基因表达谱数据动态分析(GEPIA)网站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析TCGA和GTEx数据库来源的306份宫颈癌组织和13份正常宫颈组织标本中的CXCL8表达水平。进入Survival页面绘制生存曲线图，预后指标为OS，将TCGA和GTEx数据库来源的有OS资料的宫颈癌患者292例以CXCL8中位水平为界分为CXCL8低表达和CXCL8高表达患者，比较CXCL8高、低表达患者的预后情况。

1.2.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织CXCL8表达水平 本院宫颈癌患者术后均留取新鲜组织标本于-80 ℃冻存。检测时将冰冻标本取出，解冻后打成匀浆，按照Trizol试剂盒说明书(美国Invitrogen公司)加入1 mL Trizol试剂，振荡15 s，静置2 min，4 ℃下以12 000 r/min 离心10 min。采用紫外分光光度计检测总RNA纯度。总RNA利用反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)反转录为cDNA，以cDNA为模板进行PCR反应，CXCL8引物根据NCBI数据库收录的序列，采用Oligo Architect在线引物设计软件进行设计，引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。CXCL8上游引物序列：5′-CTTTGTCCATTCCCACTTCTGA-3′，下游引物序列：5′-TCCCTAACGGTTGCCTTTGTAT-3′。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火和延伸60 s，95 ℃变性15 s，共计40个循环，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参。通过 2-ΔΔCt法计算CXCL8的表达水平。

1.3随访 采用电话和门诊复查的方式进行随访，随访截止2020年2月或患者死亡。OS的定义为从肿瘤确诊至随访截止或死亡的时间。

2 结 果

2.1在线分析宫颈癌组织CXCL8表达水平及其与预后的关系 采用GEPIA网站分析TCGA和GTEx数据库来源的宫颈癌组织中CXCL8的表达水平，结果显示，宫颈癌组织中CXCL8表达水平明显高于正常宫颈组织，差异有统计学意义(P<0.05) ，见图1。采用GEPIA网站分析TCGA和GTEx数据库来源的宫颈癌患者的预后，生存曲线分析结果显示，CXCL8低表达患者总生存率明显高于CXCL8高表达患者，差异有统计学意义(P<0.05) ，见图2。

注：*P<0.001。

图2 数据库来源的宫颈癌CXCL8高、低表达患者的生存曲线

2.2宫颈癌组织与癌旁组织CXCL8表达水平比较 本院76例患者宫颈癌组织的CXCL8表达水平(1.575±0.421)高于癌旁组织(0.705±0.272)，差异有统计学意义(P<0.05) 。

2.3CXCL8表达水平与宫颈癌临床病理特征的关系 将本院76例患者的宫颈癌组织以CXCL8水平的均值(1.575)为界分为CXCL8低表达30例和CXCL8高表达46例，分析CXCL8表达水平与宫颈癌临床病理特征的关系，结果显示，CXCL8表达水平与患者年龄、宫颈癌TNM分期、分化程度有关(P<0.05)，与宫颈癌淋巴脉管浸润、浸润深度、淋巴结转移和远处转移无关(P>0.05) ，见表1。

表1 CXCL8表达水平与宫颈癌临床病理特征的关系(n)

2.4CXCL8表达水平与宫颈癌预后的关系 对本院76例宫颈癌患者随访12～84个月，中位OS为25.80个月，其中CXCL8高表达患者的中位OS为23.65个月，低于CXCL8低表达患者的30.48个月，差异有统计学意义(P<0.05),生存曲线见图3。单因素Cox回归分析结果显示，CXCL8表达水平、TNM分期与浸润深度是宫颈癌患者预后的影响因素(P<0.05)；多因素Cox回归分析结果显示，CXCL8表达水平是宫颈癌患者预后的独立影响因素(P<0.05)，见表2。

图3 宫颈癌CXCL8高、低表达患者的生存曲线

表2 宫颈癌患者预后的影响因素分析

3 讨 论

宫颈癌是女性肿瘤相关死亡的常见原因之一。在我国，宫颈癌每年新发病例数约13.15 万,占全球宫颈癌新发病例数的28.8%[3]。高危型人乳头瘤病毒感染是宫颈癌的主要病因，而免疫抑制状态，如感染人类免疫缺陷病毒或服用免疫抑制剂等可增加对其的易感性。晚期、转移、复发的宫颈癌患者治疗效果较差，近年来免疫治疗，特别是程序性死亡受体-1、程序性死亡配体-1抑制剂等免疫治疗药物的开发和应用为晚期、复发、转移的宫颈癌患者带来了新的希望，但免疫治疗并不是对所有宫颈癌患者都有效[7]。因此，找到更多参与宫颈癌发病机制的基因或蛋白，对开发新药物、宫颈癌患者风险分层，以及实施个体化治疗都至关重要。

CXCL8是一种属于弹性蛋白样重组体的CXC趋化因子。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)等促炎细胞因子可快速诱导CXCL8的表达。有研究证实，CXCL8在食管癌、直肠癌、非霍奇金淋巴瘤组织中的表达水平较正常组织明显升高[8-10]，且在乳腺癌、肺癌、直肠癌、胃癌、胶质瘤、胰腺癌患者中高表达的CXCL8与预后呈负相关[11-16]。本研究中，TCGA和GTEx数据库来源的宫颈癌组织中CXCL8表达水平明显高于正常宫颈组织；本院76例患者宫颈癌组织的CXCL8表达水平明显高于癌旁组织，提示CXCL8表达水平升高与宫颈癌的发生有关。研究发现，阻断CXCL8在细胞内的信号传导可导致细胞增殖能力降低及细胞凋亡[17-19]，提示CXCL8参与了肿瘤的发生、进展。此外，CXCL8作为一种重要的多功能细胞因子，通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/丝氨酸激酶(AKT)、两面神激酶(JAK)/非受体型酪氨酸蛋白激酶(STAT)等信号通路发挥致癌作用[14,20]。PI3K/AKT信号通路的激活导致基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9的表达上调，从而协助肿瘤细胞在侵袭和转移过程中穿透机体天然组织屏障、基底膜和细胞外基质，增强肿瘤细胞的增殖与侵袭能力，导致肿瘤的远处转移与局部浸润[21]。此外，CXCL8通过改变与凋亡和多药耐药相关的信号通路，直接影响肿瘤细胞对化疗的敏感性，从而影响患者预后[22]。有学者发现，使用CXCL8受体拮抗剂可以抑制肿瘤微环境中的血管生成，抑制肿瘤细胞生长、增殖、迁移和侵袭[23]。鉴于以上证据，开发CXCL8及其受体拮抗剂类药物可能会为宫颈癌精准治疗带来新的希望。

本研究通过分析数据库相关资料发现CXCL8表达水平在宫颈癌组织中明显升高，且与预后有关。随后使用本院76例宫颈癌组织及癌旁组织进行了验证，进一步证实在宫颈癌组织中CXCL8表达水平明显高于癌旁组织，CXCL8表达水平与年龄、TNM分期、分化程度有关，且CXCL8表达水平是宫颈癌患者预后的独立影响因素，上述结果均提示CXCL8在宫颈癌的发生、发展过程中发挥了重要作用，可作为判断宫颈癌患者预后的指标，为临床个体化治疗提供依据。