二甲酸钾对白羽肉鸡生长性能和肠道菌群结构的影响

周寰宇，江宇航，张关令，徐美余，蔡赛波，张棋麟*，林连兵*

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；2.云南省高校饲用抗生素替代技术工程研究中心，云南 昆明 650500)

抗生素在饲料中长期不规范使用，导致畜禽体内出现细菌耐药性等问题，给环境和人类健康带来严重威胁。2006年欧盟已经全面禁止抗生素在饲料中的应用，我国农业农村部近期在《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案(2018-2021年)》中也明确指出，将于2020年7月1日起，全面退出抗生素在饲料端的使用，使开发新型高效的抗菌制剂迫在眉睫。二甲酸钾(potassium diformate，KDF)是一种有机酸盐，分子结构简单，具有完全的生物降解性，作为一种酸化剂，能够通过抑制耐酸性细菌生长，起到促进生长性能的作用[1]。二甲酸钾是欧盟于2001年批准的第一个用于替代抗生素促生长的绿色添加剂，且于2005年被我国正式批准使用于饲料中[2]。此外，二甲酸钾作用宿主的高度专一性使其在杀灭病原菌的同时，对正常菌群不会产生较大干扰。因此，二甲酸钾在抗生素替代添加剂方面具有良好的应用潜力。肠道菌群在宿主的健康与疾病中扮演了重要的角色，被称为宿主的第二基因组。目前，随着高通量测序技术的发展，检测肠道菌群应用于各类疾病的研究已成为研究热点，越来越多的研究证明，肠道菌群的紊乱是部分疾病的诱因[3]。例如，通过对腹泻仔猪与健康仔猪肠道菌群进行研究，发现腹泻仔猪的肠道菌群物种丰度相较于健康仔猪发生了显著变化，导致了功能发生紊乱[4]。特别是目前抗生素滥用现象的愈发严重，动物产生疾病时会大量服用抗生素药物，这不仅严重破坏了动物的肠道菌群平衡，还致使诸多耐药性细菌产生。研究表明，有机酸和益生菌等潜在的替抗产品对于动物的生长、改善肠道菌群，构建肠道菌群健康等方面具有良好的促进功能[5]。然而，迄今为止，人们对二甲酸钾如何影响白羽肉鸡肠道菌群的认识仍较为有限。白羽肉鸡养殖自1979年就已开始启动，因其生长速度快、肌肉蛋白质含量高等特点，在我国肉鸡类供应中占有重要地位。近年来，在“饲料禁抗”的背景下，肉鸡产业因疾病造成经济损失的风险在加大，替代抗生素的添加剂越来越重要[6]。因此，本研究选择白羽肉鸡作为动物模型，通过在饲粮中添加替代抗生素产品二甲酸钾与抗生素产品金霉素制剂进行比较，评估二甲酸钾与金霉素对白羽肉鸡生长性能和肠道菌群的影响，从而证实二甲酸钾的安全性及替代抗生素应用于畜禽养殖的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 3日龄健康白羽肉鸡苗、无添加肉鸡基础日粮(见表1)[7]，均由昆明三正生物科技(集团)有限公司生产提供。

表1 基础饲粮组成及营养水平

1.1.2 主要试剂 饲用金霉素、二甲酸钾制剂，均由昆明三正生物科技(集团)有限公司生产提供，TIANamp Stool DNA Kit(天根生物技术公司，中国)试剂盒，AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒。

1.1.3 主要仪器与设备 全自动高压蒸汽灭菌器(LDZF-75KB-II，上海申安)；超净工作台(FCH，沈阳龙腾电子有限公司)；电子天平(AS-102002A，天津)；超纯水器(JIDI-UP basic，MilliPore)；离心机(LX-100，麒麟医用)；超低温冰箱(BC-203HCN，日本三洋电器股份有限公司)；真空采血管、饲料混匀器、镊子、手术剪等。

1.2 方法

1.2.1 饲料配制与分组 供试添加剂分成6个组方，组方①：无添加肉鸡基础日粮(组名为CHE)；组方②：基础日粮中按50 mg/mL添加饲用金霉素制剂(组名为CKB)；组方③：基础日粮中按0.1%(质量分数)添加二甲酸钾制剂(组名为KDF6)；组方④：基础日粮中按0.3%(质量分数)添加二甲酸钾制剂(组名为KDF7)；组方⑤：基础日粮中按0.5%(质量分数)添加二甲酸钾制剂(组名为KDF8)；组方⑥：基础日粮中按0.7%(质量分数)添加二甲酸钾制剂(组名为KDF9)，试剂浓度均为昆明三正生物科技(集团)有限公司产品指导浓度；所有日粮均按等氮等能原则配置，饲喂日粮分为0～14 d和15～28 d两个批次，营养标准满足NRC(1998)。以上饲料组方制剂配制好后保存在阴凉干燥处备用。将378只3日龄健康白羽肉鸡，随机分为6个组，每组63只，分组详情如表2所示，每组共设3个重复，每个重复21只白羽肉鸡。其中CHE为空白对照组，其余为处理组。试验周期为28 d，以《GB/T 19664-2005》为饲养标准，分笼饲养，常规免疫，自由采食和饮水。

1.2.2 生长性能测试 试验期间每日记录采食量，分别于第1、7、14、21、28天早上8:00空腹称重，计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。ADFI(g/d)=总耗料量/试验天数，ADG(g/d)=总增重/试验天数，F/G=ADFI/ADG，其中每个分组选取5只健康白羽肉鸡进行称重，每只独立重复3次称重，并以促进生长最佳浓度作为后续试验浓度。

1.2.3 肠道菌群测序及分析 试验第28天时，取空白对照和金霉素制剂以及促生长最佳二甲酸钾组，每组取5只健康白羽肉鸡，称肉鸡活重，用乙醚麻醉法处死并解剖。将鸡盲肠无菌结扎后保存于-20 ℃冰箱，用于肠道微生物多样性检测。根据最优试验结果评估，选取CHE、CKB、FDK7共3组进行肠道微生物多样性测序分析，每组测3个生物学重复样品。总DNA的抽提使用TIANamp Stool DNA Kit试剂盒，严格按照其说明书进行。提取得到的总DNA，以通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增各样品总DNA上的16S rRNA基因的V3～V4区序列。PCR反应体系及条件参照文献[8]。PCR扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒将目标片段切胶回收。利用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统对PCR产物进行检测定量，并根据结果将各样品等量混合，而后HiSeq文库进行高通量测序，样品测序和分析由百迈客生物科技有限公司三代测序平台完成。

1.2.4 测序数据处理与分析 使用FLASH Version 1.2.7软件，通过overlap对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列即原始Tags数据；然后使用Trimmomatic Version 0.33软件，对拼接得到的原始Tags数据进行过滤，得到高质量的Tags数据；最后使用UCHIME Version 4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效数据。得到的有效数据基于百迈客云平台微生物多样性分析样本的alpha多样性和Beta多样性。

1.2.5 统计学分析 所测得数据均包含3次生物学重复，结果以平均值±标准差(SD)的方式呈现。所有实验数据采用Excel 2010进行初步整理分析，应用IBM SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，Alpha多样性指数和Beta多样性指数的组间差异分析选用t检验，显著差异水平P<0.05。采用one-way ANOVA的单因素方差分析和最小显著差异法(least-significant difference，LSD)测验不同处理的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 二甲酸钾对白羽肉鸡生长性能的影响

分别按照6个组方饲喂白羽肉鸡，在28 d的试验周期内，记录并计算出每组的料重比(F/G)来评估每组的生长状况。饲喂不同剂量二甲酸钾，发现随着浓度的增加料重比出现先下降后上升的趋势，在添加0.3%(KDF9)时白羽肉鸡的料重比最高，而添加0.7%(KDF7)料重比最低，但均与空白组(CHE)相比存在显著差异(P<0.05)(图1)。结果表明，不同剂量的二甲酸钾与金霉素添加剂量对白羽肉鸡生长性能均有提升效果，KDF7的影响效果最好。

图1 同处理之间的生长性能比较

2.2 测序数据

将促进生长的最佳二甲酸钾浓度和金霉素以及空白对照，3组实验的9个白羽肉鸡肠道菌群样本进行构建文库测序。共得到713 630条原始序列，质量控制后，得到710 426高质量序列，质控有效率达99.55%，碱基平均长度为417 bp。单独样品的测序结果如表2所示。同时，有效率为84.05%。

表2 不同白羽鸡肠道菌群样品16S rDNA测序基本信息

2.3 肠道菌群多样性结果分析

在获得OTU丰度矩阵后，对三组白羽肉鸡肠道菌群进行Alpha与Beta多样性分析，使用Chao1和Ace指数衡量物种丰度，使用Shannon和Simpson指数用于衡量物种多样性(表3)。分析CKB、KDF组与空白组CHE之间的ACE、Chao1、Shannon、Simpson等alpha多样性指数，发现CKB组和KDF组的Shannon指数均低于空白组，同时KDF组的Shannon指数低于CKB组，均存在显著差异(P<0.05)；CKB组和KDF组的Simpson指数均高于空白组，KDF组的Simpson指数与空白组相比存在显著差异(P<0.05)，而CKB组的Simpson指数与空白组相比无显著差异(P>0.05)；CKB组和KDF组的Chao1指数与空白组对比无显著差异(P>0.05)。

表3 多样性指数统计

在相同物种丰度的情况下，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，说明样品的物种多样性越高，Chao1值越大表示物种越多，Good′s Coverage用于计算覆盖率，值越大表示覆盖越好。说明金霉素和二甲酸钾都可以显著得提高白羽肉鸡的肠道菌群物种多样性，同时二甲酸钾的在提高肠道菌群物种多样性作用上比抗生素效果更好；对比KDF与CKB组之间的α多样性指数发现，KDF组的Simpson、ACE、Chao1与CKB组不存在显著差异(P>0.05)，说明二甲酸钾与抗生素对于白羽肉鸡肠道菌群结构影响效果相似。Coverage指数均大于0.999，说明测序结果已基本覆盖测序样本的多样性。

在本研究中，分别使用Weighted Unifrac算法与Bray-Curtis距离进行PCoA分析及NMDS统计，如图2A与图2B所示，PC1占总方差的65.63%，PC2占总方差的34.37%，空白组与金霉素组和二甲酸钾组样品距离明显分开，说明空白组与金霉素组和二甲酸钾组的样品菌群结构主成分具有显著差异。在无度量多维标定法统计(NMDS)中，Stress(压力)=0.000，小于0.2，说明分组及抽样方法可靠。

图2 三组样本肠道菌群的PCoA(A)和NMDS(B)

2.4 肠道菌群组成及优势菌群相对丰度分析

对白羽肉鸡肠道菌群测序数据进行注释后，得到门、属等分类单元信息。从表4看出，白羽肉鸡日粮中添加二甲酸钾28 d后，在门水平分类上，二甲酸钾处理组和空白组比较，厚壁菌门丰度百分比下调了近16%，拟杆菌门丰度百分比上调了近24%，变形菌门丰度百分比下调了近6%，Epsilonbacteraeota丰度百分比下调了1.2%。结果表明，在门水平上，饲喂二甲酸钾提高了白羽肉鸡拟杆菌门的丰度，降低了厚壁菌门、变形菌门和Epsilonbacteraeota的丰度。从表5看出，在属水平上，KDF7组与CHE组相比，巨单胞菌属所占丰度百分比下降4%、拟杆菌属上升30%、瘤胃球菌属下降3%、粪杆菌属下降1%，螺杆菌属下降1%、另枝菌属上升1%、Ruminococcaceae下降6%、理研菌属上升1%、Barnesiella下降3%，其他属下降14%；另外，在属水平上还存在30%以上的菌未被关注，需进一步分析。

表4 门分类单元下相对丰度前4细菌的变化

表5 属分类单元下相对丰度前10的变化

3 讨 论

二甲酸钾作为新型饲用酸化剂产品，在降低畜禽胃肠道疾病发生，改善肠道微生态环境方面发挥了重要作用[2]。本研究在肉鸡基础日粮中添加不同剂量的二甲酸钾，研究其对白羽肉鸡生长性能和肠道菌群的影响，并与金霉素产品进行比较。研究结果显示，抗生素(CKB)及替抗产品(KDF)与空白组(CHE)相比，对白羽肉鸡的料重比有着显著(P<0.05)下降趋势，这与以往同类产品对畜禽生长性能的影响相似[9]，说明二甲酸钾能达到金霉素同等效果。同时，研究结果发现，在白羽肉鸡的基础日粮中添加0.3%二甲酸钾效果最佳，但随着浓度的升高效果逐渐降低，这可能是因为二甲酸钾作为一种有机酸化剂，可以降低肠胃pH，随着二甲酸钾浓度增加，会使肠胃pH值过低从而失去平衡，不利于肠胃消化，如在黄羽肉鸡饲粮中添加0.6%二甲酸钾，对于肉鸡的生长无显著影响[10]。再者，对比将二甲酸钾添加到其他家禽饲料的研究报道，发现不同动物饲喂二甲酸钾的最佳浓度存在较大差异。Selle等[11]研究表明，在科宝肉鸡饲粮中添加0.6%二甲酸钾时能够有效促进肉仔鸡生长。Motoki等[12]研究表明，在日本肉鸡饲粮中添加1%二甲酸钾时能够显著提高体质量。出现这种情况，可能与二甲酸钾的质量、不同动物品种的生理及采食需求存在差异有关，此外，虽然不同动物之间对于二甲酸钾的耐受和最适添加浓度存在差异，但诸多研究[9-13]证实饲喂合理的二甲酸钾浓度能够促进畜禽生长，这与本研究在适宜浓度下饲喂白羽肉鸡的结果一致，进一步证明二甲酸钾应用于饲料的替抗潜力及安全性。

肠道微生物是动物机体的重要组成部分，在动物的生理、免疫功能以及对营养物质的吸收上发挥着重要作用，有机酸能防止病原微生物在动物肠道内定植，减少发酵过程和有毒代谢物的产生，对肠道微生物菌群发挥有益作用[14]。通过第三代测序技术对0.3%二甲酸钾组(KDF7)和金霉素组(CKB)与空白组(CHE)之间处理后的白羽肉鸡肠道菌群进行16S rDNA全长序列进行高通量测序，获得了一批高质量的数据，保证了下游肠道菌群结构分析的可靠性。通过alpha多样性指数评估饲喂抗生素替代与抗生素后的白羽肉鸡肠道菌群丰度与多样性，发现饲喂二甲酸钾与抗生素后，丰度没有明显变化，但均提高了肠道菌群物种多样性，且二甲酸钾作用效果优于抗生素。同时，经NMDS和PCoA分析发现，各样品组间明显分开，且不同处理的生物学重复样品各自聚在一起，进一步证实了饲喂二甲酸钾与金霉素组方后，白羽肉鸡肠道菌群结构产生了明显不同的结构特征，说明二甲酸钾和金霉素对畜禽肠道菌群结构具有一定的影响。

将0.3%二甲酸钾饲喂白羽肉鸡后，其肠道菌群在门分类水平，厚壁菌门、拟杆菌门、Epsilonbacteraeota的相对丰度占据前三；金霉素饲喂白羽肉鸡后，其肠道菌群在门分类水平，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门的相对丰度占据前三。以往研究发现饲喂抗生素制剂能显著降低变形菌门和Epsilonbacteraeota的相对丰度，显著提升拟杆菌门的相对丰度[15]，这与本研究饲喂抗生素制剂的变化一致。然而，饲喂二甲酸钾后，拟杆菌门相对丰度显著上升，厚壁菌门、变形菌门和Epsilonbacteraeota相对丰度显著下降，这与其他替代抗生素产品饲喂家禽后趋势相同[16]。值得注意的是，厚壁菌门比拟杆菌门会更有效地吸收食物中的热量，从而导致肥胖[17]，因此厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度增加，有助于改善白羽肉鸡代谢、减少脂肪沉积；此外，以往研究发现炎症性肠病和腹泻等疾病中，往往伴随着变形菌门和Epsilonbacteraeota相对丰度上升，拟杆菌门相对丰度降低[4]，可见饲喂0.3%的二甲酸钾和金霉素，可以减少大肠埃希菌和沙门氏菌等病原菌在肠道定植，提高免疫力，减少白羽肉鸡发病的可能。总体而言，适宜的二甲酸钾浓度和金霉素制剂可以抑制病原菌繁殖，改善动物的肠道健康状况，产生更有利的微生物菌群[18]，同时也降低了致病菌的排泻量，净化了动物的生长环境。

在属分类水平，饲喂0.3%二甲酸钾与金霉素和空白对照(CHE)相比，均提高了拟杆菌属相对丰度，其中二甲酸钾组与空白对照相比存在显著差异(P<0.05)，同时降低了Barnesiella和螺杆菌属的相对丰度。以往研究发现饲粮中添加替代抗生素产品可以提高肉鸡拟杆菌属的相对丰度[19]，这与本研究饲喂二甲酸钾的变化一致，而且研究表明患有腹泻的畜禽肠道中拟杆菌属相对丰度显著减少[20]，因此拟杆菌属的相对丰度上升可以增强白羽肉鸡机体抵抗力，减少腹泻等肠道疾病。此外，以往研究发现饲粮中添加益生菌可以显著降低肉鸡螺杆菌属和Barnesiella的相对丰度，螺杆菌属定植肠道会引起的肝炎与肠炎等疾病的发生，同时Barnesiella寄生于禽类中，也可成为急、慢性病的病原[12]，这类菌的相对丰度的降低，可以增强白羽肉鸡机体免疫力，减少肉鸡肝炎与肠炎等疾病的发生。这些证据都表明，适宜浓度的二甲酸钾作为无抗饲料添加剂饲喂白羽肉鸡后，可以改善白羽肉鸡的肠道微生态平衡，对于白羽肉鸡肠道健康具有促进作用。

本研究首次利用昆明三正生物科技(集团)有限公司开发的金霉素和替抗产品(二甲酸钾)饲喂白羽肉鸡，比较其生长性能和肠道菌群的变化。结果证实，二甲酸钾对于白羽肉鸡生长性能和肠道菌群结构的影响与金霉素相似，二甲酸钾的添加降低了白羽肉鸡的料重比，促进肉鸡快速生长发育，同时改善了肠道中微生物菌群的健康情况，表现为益生菌的丰度增加和有害菌丰度的减少。因此，二甲酸钾可以作为抗生素的替代品，具有很好的应用前景。