蜡样芽胞杆菌族毒素研究进展

郑庆芳，王东澍，吕宇飞，王恒樑，刘先凯*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.军事科学院军事医学研究院生物工程研究所 病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071)

广义的蜡样芽胞杆菌族主要包括几个具有密切关系的芽胞杆菌，分别为炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)、苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)、蕈状芽胞杆菌(Bacillusmycoides)、假蕈状芽胞杆菌(Bacilluspseudomycoides)、韦氏芽胞杆菌(Bacillusweihenstephanensis)和新种(Bacilluscytotoxicus)[1]。其中关于炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的研究较为充分。蜡样芽胞杆菌族细菌具有非常相似的生化特征和极高的基因组同源性[2]，导致物种的区分在分类学上很具挑战性；蜡样芽胞杆菌族不同物种之间普遍存在质粒水平或垂直转移，这可能会改变它们的表型[3]，在转座子、整合子、共轭元件的作用下，在该族成员间传播遗传多样性。决定蜡样芽胞杆菌族物种表型和致病性的基因大多在质粒上，由于蜡样芽胞杆菌族物种携带了大小和数量不同的质粒[4-5]，使其在致病性和宿主特异性方面表现出明显的差异。但是否含有相关致病质粒不能作为区分蜡样芽胞杆菌族菌种的依据，需依靠全基因组单核苷酸多态性分析(SNP)和多位点序列分型(MLST)等基因分析。例如分离株ISS的生理特性和生化测试显示属于蜡样芽胞杆菌，缺乏能编码炭疽毒力因子的pXO1、pXO2的质粒，但多位点序列分型和全基因组单核苷酸多态性分析表明其属于炭疽芽胞杆菌[6]。蜡样芽胞杆菌族细菌侵入宿主后，一旦不能快速准确诊断治疗，其分泌的毒素上升后将会对宿主造成很大的危害。本文对炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌产生的毒素在毒素特性、作用原理及致病性等几个方面的研究进展进行综述(表1)，简单介绍蜡样芽胞杆菌族成员之间的密切关系，并对疾病预防、治疗和生物应用的前景进行了展望。

表1 蜡样芽胞杆菌族的主要毒力因子——毒素

1 炭疽芽胞杆菌毒素

炭疽芽胞杆菌是革兰阳性菌，引起的炭疽是一种严重的人畜共患传染病[3],一般通过直接接触、呼吸道吸入、消化道进食和针头注射等途径感染宿主。炭疽芽胞曾被用于生物恐怖袭击，是一种潜在的生物战剂[4]。

1.1 炭疽毒素的来源及结构特性

炭疽毒素由炭疽芽胞杆菌产生，是导致人畜炭疽感染甚至致死的主要原因[9]，是一种AB型复合毒素，保护性抗原(Protective antigen，PA)为B亚单位，水肿因子(Edema factor，EF)和致死因子(Lethal factor，LF)为两种A亚单位。PA与EF形成水肿毒素(Edema toxin，ET)，可引起宿主细胞水肿；PA与LF形成致死毒素(Lethal toxin，LT)，导致宿主细胞死亡[10]。

PA是由pXO1质粒上的pag基因座编码，735个氨基酸残基组成的单链蛋白[11]，分子量为83 kD；EF是由pXO1质粒上的cya基因编码，767个氨基酸组成的钙调蛋白依赖的腺苷酸环化酶，是第一个在炭疽毒素中发现的具有酶活性的组分[12]；LF由pXO1质粒上的lef基因座编码，共有776个氨基酸，是一种Zn2+依赖的金属蛋白酶，包含4个结构域[13]，其中结构域4具有配位Zn2+的HEFGF基序，能实现催化活性。

1.2 炭疽毒素作用原理及致病性

炭疽芽胞杆菌的芽胞在休眠状态下进入人体，被局部的吞噬细胞吞噬并在恶劣条件下生存，在此过程中芽胞萌发形成繁殖体，并随着细菌大量繁殖释放炭疽毒素[14]，部分细菌从吞噬细胞逃逸(图1)。

图1 炭疽杆菌与宿主细胞的相互作用[15]

炭疽毒素的作用过程：首先PA与靶细胞表面的受体CMG2 或 TEM8结合[16]，然后被弗林蛋白酶(furin)等细胞膜内切酶裂解，PA裂解后的多肽片段PA63迅速寡聚化形成寡聚体[11]；一旦形成寡聚体，PA63便与EF或LF结合，引发依赖网格蛋白(clathrin)的内吞过程(图2)。在低pH环境下，PA63寡聚体可在脂质双层细胞膜上形成具有阳离子选择性的孔状结构通道[11]。当PA与TEM8结合时，PA在初级内体形成孔；当PA与CMG2结合，则需要转运至次级内体。EF和LF可通过该孔状通道从内体直接转移至细胞质或者通过次级内体的腔内囊泡(ILV)到达细胞质[17]发挥其生物学活性。EF使细胞内cAMP升高，引起宿主组织水肿，影响宿主的心血管、内分泌和免疫系统等[18]。LF裂解MEKs会导致细胞缺氧或坏死，也可能通过转运必需内吞体分选复合物(ESCRT)中的Alix、Tsg101蛋白和分选神经毒素(Sorting Nexin 3，SNX3)至腔内囊泡，在Rab11和Rab35的作用下长期保持活性并且能释放至细胞外。

图2 炭疽毒素的内吞过程[20]

人畜感染炭疽后，会有1～6 d的无症状潜伏期，随后可能出现1～5 d的类似流感的症状，然后会发作菌血症，持续1～2 d，最后因呼吸衰竭、脓毒症和休克而死亡[19]。

2 蜡样芽胞杆菌毒素

蜡样芽胞杆菌能够产生肠毒素，部分菌株可产生呕吐毒素(Ccereulide)。人摄入被污染的食品后会食物中毒，主要临床表现为呕吐和腹泻。有的蜡样芽胞杆菌致病菌株也会感染人的眼部，严重时引发突发性肝脏衰竭，导致死亡[21]。

2.1 腹泻型毒素

2.1.1 腹泻型毒素的来源及特性 蜡样芽胞杆菌引起的腹泻是由于人摄入污染食物后，在小肠中产生肠毒素而引发的感染。蜡样芽胞杆菌肠毒素主要包括溶血素BL(Hbl)、肠毒素Nhe、细胞毒素K(Cyt K)、肠毒素T(Bce T)和肠毒素(Hly II)[4-5]，其中只有肠毒素Nhe、溶血素BL 和细胞毒素K 被证明与胃肠道食物中毒有关[22]。肠毒素基因广泛存在于蜡样芽胞杆菌族中，具有高度分子多样性[23]。溶血素BL具有溶血性，由L2蛋白、L1蛋白、B蛋白组成, 分别由hblC、hblD、hblA编码[24]，分子量分别为43.5、38.2、37.5 kD；非溶血性的肠毒素Nhe是一种典型的α穿孔类毒素，由nheA、nheB和nheC编码的NheA、NheB和NheC三种蛋白质组成[25]，分子量分别为45、39和105 kD；细胞毒素K也具有溶血性，是一种由CytK编码的分子量为34 kD的细胞毒性蛋白，最初在法国爆发了严重的食物中毒事件后从蜡样芽胞杆菌NVH391/98中分离出来[26]。

2.1.2 腹泻毒素作用原理及致病性 腹泻毒素的临床表现主要为摄入污染食物8～16 h后出现腹痛、腹泻的症状，持续12～24 h。但是腹泻毒素导致人腹泻的反应机制尚不完全清晰，普遍认为毒素是穿孔毒素使小肠上皮细胞形成孔洞，Na+和Ca2+流失，细胞因电位失去平衡而凋亡。具有溶血活性的Hbl毒株会改变血管的通透性并导致皮肤坏死[4]。Beecher等[27]认为Hbl是蜡样芽胞杆菌导致腹泻的主要毒力因子，并且在L2蛋白、L1蛋白和B蛋白三种组分的共同参与下使肠毒素毒力达到最大[4]。肠毒素Nhe的三个蛋白NheA、NheB、NheC接近10∶10∶1的比例产生，三者共同作用[25]。Nhe蛋白复合物与细胞的结合还可能导致胞浆内Ca2+和活性氧(ROS)的积聚，激活Fas通路，使细胞周期在G0/G1期阻滞，引发细胞凋亡[28]。刘晓晔等[29]研究表明，Nhe的毒性靶细胞主要为上皮细胞，对细胞的侵袭力呈浓度依赖性，通过抑制其诱导的凋亡信号通路特异性中和抗体可以有效延迟和减弱细菌对细胞的侵染。细胞毒素K有CytK1和CytK2两种不同的存在形式，CytK1的细胞毒作用更强[30]。根据氨基酸序列分类，CytK属于β-桶孔形成毒素[31]，其对人类肠道Caco-2上皮细胞具有毒性[4，32]。细胞毒素K通过含甘氨酸的片段穿透细胞膜，在脂质双分子层中形成阴离子选择性通道或孔洞。这种毒素的作用方式是在上皮细胞中形成毛孔，细胞因胞内液体流出而坏死。Castiaux等[33]认为细胞毒素K参与使人腹泻的过程，但不是腹泻的致病因子。

2.2 呕吐型毒素

2.2.1 呕吐型毒素的来源及结构特性 呕吐型毒素是一种非核糖体产生的离子型环状十二肽，分子量为1.152 kD，分子式为(D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val)3[31](图3)，由位于一个270 kb的大质粒上的呕吐毒素合成酶(ces)基因簇合成[25，34]。该质粒与炭疽杆菌毒力质粒pXO1具有较高的序列相似性[35]，被命名为蜡样芽胞杆菌E4810，也被称为pCER270[36]。Apetroaie等[37]对13株产呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌进行基因组分析，发现其16S rRNA基因序列与炭疽芽胞杆菌Ames、Sterne和NC 08234-02完全相同。因此产呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌也被单独分为一个亚群，被归入新种副炭疽芽胞杆菌(Bacillusparanthracis)[38]。

图3 呕吐毒素结构式[1]

2.2.2 呕吐毒素作用原理及致病性 呕吐毒素具有耐热、耐酸的特性，活性也不受胃蛋白酶的影响[39]。目前还没有明确呕吐毒素引起人类呕吐的机制，推测呕吐毒素进入人体后与5-HT3受体结合，刺激迷走神经导致呕吐。呕吐毒素毒理与缬氨霉素很相似, 但毒性更强[40]，能将K+转入线粒体内[4]，通过抑制脂肪酸的氧化来破坏线粒体的活性，淀粉能促进呕吐毒素的产生[41]，因此呕吐食物中毒事件多与进食米面等淀粉含量高的食物有关[4]。呕吐毒素在宿主中的潜伏期很短，误食被污染的食品后0.5 h就会有头晕呕吐，伴有腹泻、发烧和四肢无力等现象。瑞士一名17岁男孩进食放置了4 d的意大利面和香蒜酱后患上了急性肠胃炎，2 d后出现肝衰竭随后死亡[21]。呕吐性食物中毒案例表明，呕吐毒素还会导致肝功能衰竭，严重可致死

3 苏云金芽胞杆菌毒素

苏云金芽胞杆菌的宿主是昆虫，常被用于病虫害的生物防治，其芽胞形成过程中产生的伴胞晶体蛋白是区别于蜡样芽胞杆菌家族其他菌株最典型的特征。苏云金芽胞杆菌作为一种天然的杀虫细菌，制成的杀虫剂安全有效[42]，在全世界广泛应用。

3.1 分泌型毒素

3.1.1 分泌型毒素的来源及结构特性 苏云金芽胞杆菌在对数生长期产生营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins, VIPs)和分泌型杀虫蛋白(secreted insecticidal protein，Sip)等可溶性毒素[8]。VIP类蛋白可分为Vip1、Vip2、Vip3和Vip4四类。Vip1和Vip2构成二元毒素，能抑制肌动蛋白聚合，主要作用于鞘翅目和半翅目昆虫[11]；Vip3的研究最为深入，特异于鳞翅目昆虫；Vip4是新发现的一类蛋白，其作用方式和靶标范围尚不清楚[43]。目前已知的Sip蛋白Sip1A对鞘翅目幼虫有毒性[44]。这些可溶性毒素在天然条件下没有活性，都是通过氨基酸序列的构象变化，将非活性毒素转化为活性毒素。Sip和VIP蛋白的分泌还增强了Cry蛋白的杀虫活性[45]。在蜡样芽胞杆菌族中，杀虫毒素并不是苏云金芽胞杆菌特有的，有的蜡样芽胞杆菌分离株也能产生Vip2，并且作用机理与苏云金芽胞杆菌一致[46]。

3.1.2 分泌型毒素的作用原理及致病性 Vip1和Vip2形成典型的AB型二元毒素，Vip2为细胞毒性A亚基，Vip1为负责细胞毒性Vip2移位到宿主细胞中的受体亚基[47-49]。B(Vip1)的蛋白水解酶活性被激活后，与细胞表面受体相互作用，形成同源七聚体，随后通过内吞体将A(Vip2)有毒成分转移到细胞质中[47]。一旦进入细胞质，A组分就破坏丝状肌动蛋白，导致细胞紊乱。目前对于Vip3蛋白的作用方式知之甚少，但是有证据表明Vip3蛋白是通过在细胞膜上形成孔隙发挥毒素作用的。被激活的Vip3A毒素与易感昆虫的中肠上皮细胞结合，导致细胞溶解，幼虫因肠道被破坏而死亡[8，48]。Sip蛋白的作用方式尚不清晰，可能是毒素使细胞膜形成孔隙引起细胞凋亡[44]，昆虫出现败血症而死。

3.2 晶体毒素

3.2.1 晶体毒素的来源及结构特性 苏云金芽胞杆菌在芽胞形成期会产生伴胞晶体。伴胞晶体是一种不溶性杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)，也称δ-内毒素(delta-endotoxin)，可分为Cry(crystal)毒素和Cyt(cytolytic)毒素两大家族[50-52]。Cry毒素包含3-结构域毒素类、类Mtx1素类、Cry6类、二元毒素类、Cry22类和伴胞素类[52]。Cyt毒素分为Cyt1和Cyt2两类，在体外具有溶血活性，也被称为溶细胞素。Cry毒素分子量在70～140 kD之间，Cyt毒素分子量较小，仅27 kD左右，与Cry毒素没有很高的同源性[53]。在苏云金芽胞杆菌杀虫毒素中，Cry毒素是最大的群体[54]，并且与Cyt毒素相比，Cry毒素对幼虫的毒性更大[55]。苏云金芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌唯一的区别在于苏云金芽胞杆菌质粒中存在抗昆虫毒素的编码基因。Cry毒素和Cyt毒素分别由位于大质粒上的杀虫基因cry和cyt编码[48]，携带杀虫基因的质粒可以在炭疽芽胞杆菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌之间转移[56-57]。

3.2.2 晶体毒素的作用原理及致病性 与炭疽芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌不同，苏云金芽胞杆菌虽然对几种哺乳动物的细胞系有毒性[58]，但真正的宿主是节肢动物，其对人类或者其他生物没有毒性[59]。据报道，伴胞素类还能对不同来源的人类癌细胞具有特异的杀灭活性[58]。Cry毒素在双翅目昆虫体内有特异性活性，被幼虫摄入后在其中肠中被蛋白酶溶解，激活为Cry毒素[60]。Cry毒素穿过周转基质与中肠上皮细胞的钙黏蛋白等受体结合[61]，从而激活细胞死亡途径，再与碱性磷酸酶(ALP)或者氨基肽酶(APN)顺序结合，形成低聚物，然后插入膜中，形成孔洞，改变细胞渗透压使其死亡[62]。细菌在破坏昆虫中肠上皮后进入血腔，使其出现败血症而死亡[63](图4)。Cyt毒素体外和体内作用机理不同，在体外具有溶细胞作用。Cyt晶体被肠道蛋白酶水解激活，Cyt毒素与受体不饱和磷脂结合形成低聚物，然而低聚物是否在细胞膜上形成孔洞还不明确。Cyt毒素在体内主要对双翅目昆虫具有毒力，部分Cyt蛋白的表达需要蛋白P20的辅助，与Cry毒素具有协同作用。Cyt毒素的杀虫谱较窄，本身杀虫活性不高，但能增强Cry蛋白的杀虫活性，并且能降低双翅目害虫对Cry蛋白的抗性，提高Cry毒素的杀虫效率[53]。

图4 Cry毒素杀虫的作用机理[64]

4 展 望

外毒素是蜡样芽胞杆菌族主要的毒力因子，在各方面存在着区别与联系。在结构特性上，炭疽毒素、蜡样芽胞杆菌呕吐毒素和苏云金芽胞杆菌的Cry毒素均由质粒编码，其中呕吐毒素为肽类毒素，其他为蛋白质毒素。在作用机制上，蜡样芽胞杆菌肠毒素、苏云金芽胞杆菌毒素同属于穿孔类毒素，使细胞膜形成孔道导致细胞死亡。在致病性上，炭疽毒素的受体广泛分布于各组织器官中，对多种哺乳动物细胞均具有杀伤作用，危害性大；蜡样芽胞杆菌毒素主要作用于胃肠道，引发食物中毒；而苏云金芽胞杆菌毒素主要杀伤昆虫，特异性强，对环境友好，是目前广泛应用的微生物杀虫剂。

蜡样芽胞杆菌族种类繁多，关系复杂。基因组的高同源性和质粒的水平转移，可能给蜡样芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌抗生素治疗带来很大问题。炭疽杆菌水肿毒素在感染中的作用和蜡样杆菌呕吐毒素致病机理目前尚不十分明确，迫切需要探索和开发阻止炭疽毒素和蜡样毒素从头生物合成的方法。苏云金芽胞杆菌应探究如何在不发生芽胞形成的情况下提高Cry蛋白表达效率，方便Cry蛋白收集，提高杀虫剂产量。