淡竹叶浸出物提取方法的建立及其质量标准研究△

鲁云，李燕珍，林碧珊，王寿富，魏梅，孙冬梅，梁志毅

广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244

淡竹叶始载于《滇南本草》[1]，《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版记载淡竹叶为禾本科植物淡竹叶LophatherumgracileBrongn.的干燥茎叶，其性寒，味苦，具有清热泻火、除烦止渴、利尿通淋等功效[2]，主要分布于我国广东、湖南、广西、福建、浙江、安徽等地[3]。有相关文献记载，淡竹叶的化学成分主要以黄酮类为主，此外，还有挥发油类、三萜类、酚酸、多糖、氨基酸等[4-6]。现代药理研究表明，淡竹叶有解热、利尿、镇痛、抗菌等作用[7]，除作药用外，淡竹叶还可应用于食品、保健品等领域[8]。随着淡竹叶的广泛应用，如何控制淡竹叶浸出物的质量标准成为亟待解决的问题。目前，除2010年版《湖南省中药饮片炮制规范》有收载“淡竹叶的浸出物检查”外(其采用热浸法70%乙醇作溶剂提取，并要求浸出物得率不得少于9.0%)，历版《中国药典》与其他各地中药饮片炮制规范对淡竹叶药材的质量控制指标均未有浸出物的相关记载[9]。因此，淡竹叶浸出物的最佳提取方法以及质量标准尚无明确参考依据。

本研究对淡竹叶浸出物得率、异荭草苷含量、日当药黄素含量、特征图谱总峰面积及过滤速度进行综合评价，优选淡竹叶的浸出物提取方法，建立淡竹叶浸出物质量控制指标，为其他药材浸出物的提取及其浸出物质量控制指标的建立提供实验参考。

1 材料

1.1 仪器

H-class型超高效液相色谱仪、光电二极管阵列检测器(PDA)、Empower工作站(沃特世公司)；KQ-700DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q Direct型超纯水系统(默克股份有限公司)；ME204E型万分之一天平(Mettler Toledo公司)；DHG-9147A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。

1.2 试药

异荭草苷对照品(批号：111974-201401，纯度：94.0%，中国食品药品检定研究院)；日当药黄素对照品(批号：18082822，纯度：99.7%，上海同田生物技术股份有限公司)；乙醇(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)；磷酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，默克股份有限公司)；水(Milli-Q Direct超纯水)。

12批淡竹叶药材来源信息见表1，经过广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定为禾本科植物淡竹叶LophatherumgracileBrongn.的干燥茎叶，且符合《中国药典》2015年版要求。

表1 淡竹叶样品信息

2 方法

2.1 浸出物提取方法

2.1.1冷浸法 取淡竹叶药材供试品约4 g，精密称定，共12份，分别以水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇为溶剂(每种溶剂平行测定3份)，按照《中国药典》2015年版通则2201项下冷浸法测定，依次计算浸出物得率，并记录过滤速度快慢。

2.1.2热浸法 取淡竹叶药材供试品约4 g，精密称定，共12份，分别以水、50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇为溶剂(每种溶剂平行测定3份)，按照《中国药典》2015年版通则2201项下热浸法测定，依次计算浸出物得率，并记录过滤速度快慢。

2.2 色谱条件

色谱柱：Waters CORTECS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～2 min，10%A；2～3 min，10%～16%A；3～7.5 min，16%A；7.5～16 min，16%～52%A)；柱温：40 ℃；流速：0.25 mL·min-1；检测波长：350 nm；进样量：1 μL。

2.3 对照品溶液的制备

取异荭草苷对照品、日当药黄素对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成含异荭草苷19.776 μg·mL-1、日当药黄素16.130 μg·mL-1的对照品溶液，即得。

2.4 供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，称定质量，超声处理(功率：500 W，频率：40 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用60%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取2.1项下冷浸法与热浸法续滤液适量，滤过，取续滤液备用。

2.5 专属性试验

吸取对照品溶液、阴性对照溶液及供试品溶液，按2.2项下色谱条件分别测定。结果表明，阴性对照溶液在对照品溶液色谱峰相应位置无吸收，阴性对照无干扰，方法专属性良好，见图1。

注：A.对照品溶液；B.阴性对照溶液；C.供试品溶液；2.异荭草苷；3.日当药黄素。图1 淡竹叶对照品溶液、阴性对照溶液、供试品溶液HPLC图

2.6 线性关系考察

精密量取质量浓度为102.037 μg·mL-1的异荭草苷对照品母液以及质量浓度为102.292 2 μg·mL-1的日当药黄素对照品母液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、8.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度。分别将稀释后不同浓度的对照品溶液及对照品母液，按2.2项下色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标(Y)，以进样质量浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，得回归方程：异荭草苷Y1=10.952X1-0.752 7(r1=0.999 8)，质量浓度为1.020 4～102.037 0 μg·mL-1；日当药黄素Y2=10.192X2-0.157 1，(r2=0.999 9)，质量浓度为1.022 9～102.292 2 μg·mL-1。表明异荭草苷、日当药黄素在以上范围内进样质量浓度与峰面积线性关系良好。

2.7 精密度试验

取S1样品粉末1.0 g，按2.4项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件，重复进样6次，测定峰面积，计算峰1、异荭草苷、日当药黄素、峰4峰面积的RSD分别为1.93%、0.10%、0.45%、0.52%，表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

取S1样品粉末1.0 g，平行6份，按2.4项下方法分别制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件，进样测定峰面积，计算峰1、异荭草苷、日当药黄素、峰4峰面积的RSD分别为1.93%、2.02%、1.96%、2.48%，表明方法的重复性良好。

2.9 稳定性试验

取S1样品粉末1.0 g，按2.4项下方法制备供试品溶液，室温放置，分别于0、4、8、12、16、20、24 h 后按2.2项下色谱条件，进样测定峰面积，计算峰1、异荭草苷、日当药黄素、峰4峰面积的RSD分别为0.40%、1.70%、4.26%、1.22%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知指标成分含量的淡竹叶药材，精密称定，每组3份，按对照品加入量与所取供试品中待测定成分量分别为0.5∶1、1∶1、1.5∶1加入异荭草苷、日当药黄素对照品，按2.2项下色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表2，回收率均为99.48%～105.22%，表明回收率良好。

表2 异荭草苷、日当药黄素加样回收率试验结果(n=9)

3 结果

3.1 不同提取方法对淡竹叶浸出物得率及特征图谱的影响

3.1.1不同提取方法浸出物的HPLC图谱比较 不同提取方式及不同提取溶剂下的浸出物色谱图见图2，4个特征峰基本一致，但各峰的峰面积存在较大的差异。

注：1.淡竹叶药材；2.冷浸法-水；3.冷浸法-50%乙醇；4.冷浸法-75%乙醇；5.冷浸法-95%乙醇；6.热浸法-水；7.热浸法-50%乙醇；8.热浸法-75%乙醇；9.热浸法-95%乙醇。图2 不同提取方法浸出物与淡竹叶药材(S11)HPLC 图谱比较

3.1.2不同提取方法浸出物的HPLC 图谱相似度分析 以淡竹叶药材特征图谱作为对照图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)分析各提取方法浸出物图谱与药材图谱的相似度。

结果显示，在水、95%乙醇提取下，浸出物图谱与药材图谱之间的相似度为0.849～0.986，相对较低。而50%乙醇、75%乙醇提取下，其图谱与药材图谱之间相似度在0.998以上，相似度较高，说明50%乙醇、75%乙醇适用于提取淡竹叶药材中的有效成分。

3.1.3不同提取方法对浸出物中各评价指标的影响 取 S1样品，按2.1和2.4项下所得的样品，计算干燥品水溶性与醇溶性浸出物得率、异荭草苷含量、日当药黄素含量，计算特征图谱4个特征峰的总峰面积，根据过滤速度依次评分为2、4、4、5，结果见表3。

表3的结果显示，相同提取溶剂下，浸出物得率，浸出物中异荭草苷含量、日当药黄素含量，4个特征峰的总峰面积，热浸法均高于冷浸法。相同的提取方式下，冷浸法浸出物得率顺序为50%乙醇>水>75%乙醇>95%乙醇。热浸法浸出物得率顺序为50%乙醇>水>75%乙醇>95%乙醇；根据以上2个成分含量及总峰面积结果可知，50%乙醇和75%乙醇提取下，2种成分的含量和总峰面积比水和95%乙醇提取的高。

3.1.4提取方法的综合评价 浸出物得率能反映药材的提取程度，是评价中药材质量的手段之一。异荭草苷、日当药黄素均为淡竹叶中含量较高的黄酮类成分，异荭草苷具有较强的抑菌等作用，日当药黄素是一种强的抗氧化剂，具有改善血液循环等功能，2种成分的含量可以体现成分在药材中的质量水平[10-12]，特征图谱可较全面反映药材的质量[5]。在实际操作过程中，不同提取方式及不同提取溶剂的过滤速度存在较大差异，对实验结果重现性造成影响。故以浸出物得率、2个成分含量、特征峰总峰面积及过滤速度作为浸出物提取方法优化的关键因素，每个关键因素均设为100%，并按照浸出物得率大小、成分含量高低、总峰面积大小、过滤速度得分，依次计算实际占比。通过层次分析法将浸出物得率、异荭草苷含量、日当药黄素含量、总峰面积、过滤速度的权重比例设定为3、2、2、2、1，计算不同溶剂下淡竹叶浸出物提取方法的综合分值，结果见表4。

冷浸法中水的浸出物得率占比=冷浸法中水的浸出物得率/(冷浸法浸出物得率之和+热浸法浸出物得率之和)×100%

(1)

表3 淡竹叶不同提取方法浸出物中各指标结果

表4 淡竹叶不同提取方法浸出物的综合评分结果

加权评分=浸出物得率加权系数×占比

(2)

总得分=浸出物得率加权评分+异荭草苷含量加权评分+日当药黄色素含量加权评分+总峰面积加权评分+过滤速度加权评分

(3)

以上关键因素加权总得分结果显示，热浸法明显优于冷浸法，热浸法50%乙醇提取下淡竹叶浸出物总得分最高，综合评分为173.4，故确定淡竹叶浸出物的提取方法为热浸法50%乙醇提取。

3.2 淡竹叶浸出物质量标准的建立

按照优选的淡竹叶浸出物提取方法，对来源于主产区的12批淡竹叶药材进行测定，平行测定 3次。结果见表5。

表5 12批淡竹叶浸出物得率

表5结果显示，来自6个不同产地的淡竹叶其浸出物得率无较大差异。12批淡竹叶药材浸出物得率的均值为(15.78±3.04)%，波动范围为10.40%～20.04%。取淡竹叶浸出物范围为均值加减1倍标准差，即12.73%～18.82%，12批淡竹叶浸出物中有2批不在此范围内；取浸出物得率范围为均值加减2倍标准差，即9.69%～21.87%，12批淡竹叶的浸出物均在此范围内；取浸出物得率范围为均值加减3倍标准差，即6.64%～24.91%，范围较大。考虑此12批药材的代表性及药材质量的波动性，为严格控制淡竹叶药材的浸出物，结合12批淡竹叶浸出物的波动范围，最终确定淡竹叶浸出物得率为9.69%～21.87%。

4 讨论

本实验采用水和不同体积分数乙醇为溶剂，通过冷浸、热浸2种方式进行提取。实验结果显示，在不同的提取条件下，浸出物中各指标结果均存在明显差异。水提取的浸出物得率高，但指标成分的含量及特征峰总峰面积均最低，且过滤速度极慢、不易操作。95%乙醇提取的浸出物得率最低，提取出的有效成分较少，不利于药材质量控制。相比于75%乙醇提取，50%乙醇提取所得的浸出物得率、日当药黄素的含量及特征峰总峰面积高，且过滤速度均较快，故确定最佳提取条件为热浸法50%乙醇溶液提取。在此基础上，本次实验共测定了12批淡竹叶药材的浸出物得率，并根据12批淡竹叶浸出物得率制订了淡竹叶药材的浸出物范围。结果显示，不同产地药材的浸出物得率差异无统计学意义，淡竹叶药材的浸出物得率为9.69%～21.87%。

中药包含的成分复杂多样，除了对其主要成分进行含量测定外，还要通过指纹图谱或特征图谱等进行多组分的研究分析，从而更能体现药材质量的整体性。通过浸出物得率并结合浸出物的指标成分含量及特征图谱进行综合分析，为淡竹叶浸出物的提取方法提供参考。