MALAT1通过调控miR-146a减轻关节软骨细胞凋亡和基质降解的研究

宋超，王冶，蒲劲松，陈林，郭浩然，崔瀚文

(川北医学院附属医院 骨科，南充 637000)

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种慢性退行性关节疾病，关节软骨降解、软骨下骨硬化、滑膜炎以及骨赘形成是OA常见的病理特征。OA频繁地发生于老龄人群中，可导致患者关节疼痛、功能失调、残疾[1-2]。尽管如今已发展出诸如药物治疗、针灸疗法、电磁治疗、干细胞疗法等治疗方式，但OA依然难以彻底治愈[3-4]。转移相关肺腺癌转录本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)最早发现于与非小细胞肺癌患者生存相关的转录产物筛选，研究发现其与许多人类疾病有着密切关系[5]。Liang等[6]研究发现，MALAT1/miR-127-5p可调控骨桥素介导的软骨细胞增殖，从而对OA起调控作用。尽管有文献报道在急性肾损伤中MALAT1与miR-146a存在相互作用[7]，但MALAT1和miR-146a是否参与了对OA的调控尚未见报道。本研究通过培养人软骨细胞株CHON-001，并经过miR-146a或MALAT1重组过表达载体转染以及IL-1β处理，探究MALAT1/miR-146a对软骨细胞凋亡及细胞外基质降解的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床样本获取 从川北医学院附属医院接受了全膝关节置换手术的OA患者身上获取OA关节软骨组织20例，从接受了截肢手术的非OA患者身上获取普通关节软骨组织20例，所有软骨组织的获取均遵照中国骨科学会骨关节炎研究医学会的诊断标准，组织样本经手术摘取后立即通过液氮速冻保存。本研究得到了医院伦理委员会的支持以及患者本人的知情同意。

1.1.2 主要试剂 DMEM培养液、FCS购自美国Gibco公司，IL-1β购自美国Sigma公司，CCK-8试剂盒、Hoechst试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，反转录试剂盒、双荧光素酶报告基因检测系统购自美国Promega公司，SYBR GreenMix试剂盒购自日本TaKaRa公司，miR-146a、mimics NC及pcDNA 3.0-MALAT1重组过表达载体由上海吉玛制药技术有限公司合成，活化型半胱天冬酶3(cleaved caspase 3，cl-CASP3)、B细胞淋巴瘤因子2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、基质金属蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP-13)、带有血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素金属蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS-5)、Ⅱ型胶原蛋白(collagen Ⅱ，COL2)、聚蛋白聚糖、β-actin一抗及辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的二抗购自英国Abcam公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人关节软骨细胞株CHON-001购自美国ATCC，采用含0.1 mg/L G-418和10%FCS的DMEM培养液在5%CO237 ℃环境中培养。

1.2.2 细胞分组及处理方法 将细胞分为空白对照组、IL-1β组、阴性对照(negetive control，NC)组、miR-146a组、MALAT1组以及miR-146a+MALAT1组，按照Lipofectamine 2000试剂的操作说明，NC组转染mimics NC，miR-146a组转染miR-146a mimics，MALAT1组转染pcDNA3.0-MALAT1重组过表达载体，miR-146a+MALAT1组共转染miR-146a和MALAT1过表达载体，在48 h的转染后，除空白对照组外，其余各组均使用10 ng/mL的IL-1β处理细胞，24 h后进行检测。

1.2.3 RT-PCR检测基因表达 通过TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，按照反转录试剂盒提供的方法反转录合成cDNA，根据SYBR GreenMix试剂盒提供的方法进行RT-PCR，循环条件为：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，反应进行40个循环。采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平。

1.2.4 双荧光素酶报告基因试验检测靶向作用关系 构建MALAT1的pGL3 luciferase promoter野生型(WT)和突变型(MUT)载体，将重组载体分别与miR-146a mimics或mimics NC共转染HEK293T细胞，转染24 h后采用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。

1.2.5 CCK-8检测细胞增殖水平 在常规条件下培养各组细胞，每24 h取1次样，采用CCK-8试剂检测细胞光密度[D(450 nm)]，共检测3 d。将取样的细胞接种于96孔板中，每孔加入10 μL CCK-8试剂，4 h后用酶标仪检测D(450 nm)，通过标准曲线计算各时间点细胞增殖的倍数。

1.2.6 Hoechst检测细胞凋亡水平 将各组细胞接种于6孔板中，使用4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.5% TrintonX-100透膜处理，Hoechst荧光染料进行30 min染色。在荧光显微镜下观察细胞的凋亡情况，将细胞核固缩、核致密浓染及碎片化致密浓染的细胞视为凋亡细胞。细胞凋亡率计算公式为：细胞凋亡率 = 凋亡细胞/细胞总数 × 100%。

1.2.7 Western blotting检测蛋白表达 用RIPA裂解液对各组细胞总蛋白进行提取，用BCA蛋白定量试剂盒对各组总蛋白浓度进行检测，每组取30 μg蛋白进行点样，用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，半干转膜法转移蛋白至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%牛血清白蛋白4 ℃封闭2 h，加入对应一抗4 ℃孵育过夜， TBST缓冲液洗3次，用HRP标记的二抗室温孵育1 h，电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)显色液显影，用凝胶成像系统扫描灰度分析蛋白质的相对表达水平。

2 结果

2.1 OA关节软骨组织MALAT1与miR-146a表达的相关性对OA关节软骨组织和普通关节软骨组织MALAT1和miR-146a的相对表达水平进行检测。结果显示，OA关节软骨组织MALAT1的相对表达水平较普通关节软骨组织显著升高(P<0.05)，miR-146a的相对表达水平显著降低(P<0.05)。OA关节软骨组织MALAT1与miR-146a的相对表达水平呈负相关(r=-0.907 8，P<0.001)。(图1)

注：A.RT-PCR检测关节软骨组织中MALAT1表达；B.RT-PCR检测关节软骨组织中miR-146a表达；C.Spearman法分析MALAT1与miR-146a表达的相关性。*P<0.05。图1 临床关节软骨组织中MALAT1和miR-146a的相对表达水平及其相关性

2.2 miR-146a和MALAT1的相互作用关系对CHON-001细胞中miR-146a和MALAT1的表达进行检测。结果显示，与空白对照组细胞比较，在IL-1β组细胞miR-146a的相对表达水平显著降低(P<0.01)，MALAT1的相对表达水平显著升高(P<0.01)。进一步对miR-146a和MALAT1的靶向关系进行验证，结果显示，在MALAT1-WT组中，与经过mimics NC处理的细胞比较，经过miR-146a mimics处理的细胞其相对荧光素酶活性显著降低(P<0.01)；在MALAT1-MUT组中，经过mimics NC处理的细胞与经过miR-146a mimics处理的细胞比较，相对荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。(图2)

注：A.RT-PCR检测CHON-001细胞中miR-146a和MALAT1的表达；B.双荧光素酶报告基因试验检测miR-146a和MALAT1的靶向作用关系。n=6；与空白对照组比较，**P<0.01；与mimics NC比较，##P<0.01。图2 miR-146a与MALAT1相互作用关系的验证

2.3 MALAT1对miR-146a表达的影响CHON-001细胞转染mimics NC、miR-146a mimics或pcDNA3.0-MALAT1后，对细胞miR-146a的表达水平进行检测。与空白对照组比较，IL-1β组细胞miR-146a的相对表达水平显著降低(P<0.01)；与IL-1β组比较，NC组细胞miR-146a的相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，miR-146a组细胞miR-146a的相对表达水平显著升高(P<0.001)，MALAT1组细胞miR-146a的相对表达水平显著降低(P<0.01)；与miR-146a组比较，miR-146a+MALAT1组细胞miR-146a的相对表达水平显著降低(P<0.01)。(图3)

注：n=6；与空白对照组比较，**P<0.01；与IL-1β组比较，##P<0.01，###P<0.001；与miR-146a组比较，△△P<0.01。图3 RT-PCR检测MALAT1对miR-146a相对表达水平的影响

2.4 miR-146a和MALAT1对关节软骨细胞增殖的影响对CHON-001细胞增殖水平进行检测。结果显示，与空白对照组比较，IL-1β组细胞增殖倍数显著降低(P<0.01)；与IL-1β组比较，NC组细胞增殖倍数差异无统计学意义(P>0.05)，miR-146a组细胞增殖倍数显著降低(P<0.01)，MALAT1组细胞增值倍数显著升高(P<0.01)；与miR-146a组比较，miR-146a+MALAT1组细胞增殖倍数显著升高(P<0.01)。(图4)

2.5 miR-146a和MALAT1对关节软骨细胞凋亡的影响对CHON-001细胞凋亡水平进行检测。结果显示，与空白对照组比较，IL-1β组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)；与IL-1β组比较，NC组细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，miR-146a组细胞凋亡率显著升高(P<0.01)，MALAT1组细胞凋亡率显著降低(P<0.01)；与miR-146a组比较，miR-146a+MALAT1组细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。(图5)

注：n=6；与空白对照组比较，**P<0.01；与IL-1β组比较，##P<0.01；与miR-146a组比较，△△P<0.01。图4 CCK-8检测miR-146a和MALAT1对CHON-001细胞增殖的影响

2.6 miR-146a和MALAT1对关节软骨细胞凋亡标志蛋白表达的影响对CHON-001细胞凋亡标志蛋白表达水平进行检测。结果显示，与空白对照组比较，IL-1β组细胞cl-CASP3和Bax相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，Bcl-2相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)；与IL-1β组比较，NC组细胞cl-CASP3、Bax和Bcl-2相对蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，miR-146a组细胞cl-CASP3和Bax相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，Bcl-2相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，MALAT1组细胞cl-CASP3和Bax相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，Bcl-2相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与miR-146a组比较，miR-146a+MALAT1组细胞cl-CASP3和Bax相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，Bcl-2相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。(图6)

注：A.Hoechst检测细胞凋亡形态；B.miR-146a和MALAT1对细胞凋亡的影响。n=6；与空白对照组比较，**P<0.01；与IL-1β组比较，##P<0.01；与miR-146a组比较，△△P<0.01。图5 Hoechst检测miR-146a和MALAT1对CHON-001细胞凋亡的影响

注：A.Western blotting检测细胞凋亡标志蛋白的表达；B.miR-146a和MALAT1对细胞凋亡标志蛋白表达的影响。n=6；与空白对照组比较，**P<0.01；与IL-1β组比较，##P<0.01；与miR-146a组比较，△△P<0.01。图6 Western blotting检测miR-146a和MALAT1对CHON-001细胞凋亡标志蛋白表达的影响

2.7 miR-146a和MALAT1对细胞外基质降解的影响对CHON-001细胞的细胞外基质相关蛋白的表达进行检测。结果显示，与空白对照组比较，IL-1β组细胞MMP-13和ADAMTS-5相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，COL2和聚蛋白聚糖相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)；与IL-1β组比较，NC组细胞MMP-13、ADAMTS-5、COL2和聚蛋白聚糖相对蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，miR-146a组细胞MMP-13和ADAMTS-5相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)，COL2和聚蛋白聚糖相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，MALAT1组细胞MMP-13和ADAMTS-5相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，COL2和聚蛋白聚糖相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与miR-146a组比较，miR-146a+MALAT1组细胞MMP-13和ADAMTS-5相对蛋白表达水平显著降低(P<0.01)，COL2和聚蛋白聚糖相对蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。(图7)

注：A.Western blotting检测细胞外基质相关蛋白的表达；B.miR-146a和MALAT1对细胞外基质相关蛋白表达的影响。n=6；与空白对照组比较，**P<0.01；与IL-1β组比较，##P<0.01；与miR-146a组比较，△△P<0.01。图7 Western blotting检测miR-146a和MALAT1对CHON-001细胞的细胞外基质相关蛋白表达的影响

3 讨论

软骨细胞是关节软骨构成中唯一的一种细胞类型，被包裹在由自身合成的细胞外基质中。尽管这种细胞仅占关节软骨组织1%的体积，但其在维持基质的组成和完整性上是不可缺少的。在OA发病时可观察到进行性软骨退化病变，同时可观察到空骨陷窝形成以及软骨细胞缺少，表明软骨细胞死亡与OA的发生、发展有着密切联系[8-9]。研究发现，MALAT1可通过miRNA分子海绵作用竞争性结合miR-127-5p，参与对软骨细胞增殖的调控[6]。miR-146a在Li等[10]的研究中被报道参与了软骨细胞凋亡的调控，而MALAT1是否可通过与miR-146a靶向作用参与对软骨细胞的调控尚未见报道。本研究对临床OA样本中MALAT1和miR-146a的表达进行检测，发现OA样本中MALAT1表达水平升高，同时miR-146a表达水平下降，两者的变化呈明显的负相关趋势。体外培养的软骨细胞经过IL-1β处理后，miR-146a和MALAT1表达水平的变化与临床样本一致。双荧光素酶报告基因试验显示，miR-146a与MALAT1具有靶向作用关系。本研究结果表明，MALAT1在软骨组织及细胞中表达水平升高，并可靶向抑制miR-146a的表达。

为了进一步探究MALAT1和miR-146a的相互作用对软骨细胞增殖、凋亡可能存在的影响，本研究用miR-146a mimics或MALAT1过表达载体转染了经IL-1β处理的软骨细胞，发现MALAT1过表达可显著降低细胞中miR-146a的表达水平。同时miR-146a过表达显著抑制了细胞增殖，并促进细胞凋亡，而MALAT1过表达可扭转miR-146a对细胞增殖和凋亡的作用。此外本研究发现，miR-146a过表达显著提升了cl-CASP3和Bax蛋白水平，同时降低Bcl-2蛋白水平。cl-CASP3是细胞凋亡过程中的主要效应因子，而抗凋亡基因Bcl-2可与促凋亡基因Bax形成二聚体从而抑制凋亡的发生，三者常被用作检测细胞凋亡的分子标志物[11-13]。上述结果表明，MALAT1靶向抑制miR-146a表达可促进OA软骨细胞恢复增殖，并抑制其凋亡。

细胞外基质降解是OA病理变化过程中的一个重要机制，随着疾病进展，聚蛋白聚糖显著减少，同时COL2在OA变性区域水平降低，而ADAMTS-5和MMP-13分别是降解COL2和聚蛋白聚糖的主要酶，在OA软骨病变的初期，其表达量就会上调[14-16]。本研究发现，在IL-1β处理的软骨细胞中，miR-146a过表达可显著上调MMP-13和ADAMTS-5的表达，并下调COL2和聚蛋白聚糖的表达，而MALAT1过表达可扭转miR-146a对这些蛋白的调控，提示miR-146a可提高细胞外基质降解水平，MALAT1可通过靶向抑制miR-146a表达来抑制OA软骨细胞的细胞外基质降解。

综上所述，MALAT1可与miR-146a发生靶向作用，抑制OA软骨细胞内miR-146a表达，进而促进软骨细胞恢复增殖，抑制凋亡，并阻止软骨细胞的细胞外基质降解。本研究探究了MALAT1通过竞争性结合miR-146a对软骨细胞增殖和凋亡的调控作用，为OA的治疗提供了新的思路。本研究还存在不足之处，后期计划对miR-146a下游靶向调控基因进行进一步探究，并通过动物实验对MALAT1及miR-146a的作用机制进行验证。