哮喘-慢性阻塞性肺疾病患者外周血Treg/Th17失衡的研究

时靖峰，韩明锋，滕小宝，张小华

(阜阳市第二人民医院 呼吸与危重症科，阜阳 236015)

支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)是临床常见的2种气道阻塞性疾病，部分患者会出现哮喘和COPD并存的情况，称为哮喘-慢性阻塞性肺疾病(asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap， ACO)[1]。流行病学数据显示，ACO好发于中老年人且其发病率逐年升高，严重影响公民健康[2]。目前，ACO的发病机制尚未完全明晰，但普遍认为气道炎症、阻塞及其高反应性是疾病重要的病理生理基础，其中系统性炎症反应是关键环节[3]。Treg和Th17是重要的免疫组分，其在维持机体免疫平衡方面作用突出[4]。大量研究指出，Treg/Th17失衡可能与哮喘、COPD的发生密切相关[5-6]。ACO兼具哮喘和COPD的临床表现，但其临床特征、病理生理机制及相关诊断指标仍不明确完善。研究将比较ACO、哮喘、COPD患者外周血Treg、Th17及其细胞因子水平和肺功能，初步分析它们的诊断价值，以提高临床ACO的诊断水平。

1 资料与方法

1.1 纳入标准收集2018年6月至2019年6月于阜阳市第二人民医院就诊的ACO患者52例(ACO组)，哮喘急性发作期患者34例(哮喘组)，COPD急性加重期患者45例(COPD组)及健康体检者30例(健康组)。纳入标准：(1)ACO患者符合西班牙专家共识中ACO的诊断标准[7]；(2)哮喘急性发作期患者符合《支气管哮喘防治指南》[8]中哮喘的诊断标准；(3)COPD急性加重期患者符合《慢性阻塞性肺疾病诊治指南》[9]中COPD的诊断标准；(4)健康体检者各项实验室生化指标均正常；(5)受试者年龄18～80岁。排除标准：(1)胸部影像学表现明显异常；(2)近3个月有吸烟、酗酒史；(3)48 h内使用过支气管扩张剂、激素类药物；(4)有恶性肿瘤病史；(5)存在先天性免疫功能缺陷；(6)伴有心脏、肝脏、肾脏等重要脏器功能不全；(7)合并其他呼吸道疾病者。该研究已获得医院医学伦理委员会批准，入组对象及家属均自愿签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器 抗CD4、CD25流式抗体，购自IMMUNOSTEP公司；ELISA检测试剂盒，购自Cygnus Technologies股份有限公司；FCM，来自常州必达科生物科技有限公司；NIOX NO测定仪，来自Aerocrine AB公司；肺功能仪，来自德国耶格公司。

1.2.2 样本采集及细胞分离 分别采集入组对象外周静脉血5 mL，抗凝处理后600×g离心10 min，分离血浆并于-80 ℃保存。采用Ficoll密度梯度离心法分离样本PBMC，调整密度至2×106个/mL，重悬于RPMI 1640培养液中。

1.2.3 FACS检测受试者外周血Treg、Th17百分比 将制备的PBMC加入24孔板，加入佛波酯和离子霉素，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h。收集细胞并分为同型对照组和实验组，分别加入抗CD4、CD25抗体，避光孵育30 min；漂洗后加入Fix/Perm液固定、穿膜；分别加入抗Foxp3、IL-17和同型对照抗体，室温避光孵育1 h；漂洗样本后重悬，FCM检测Treg、Th17百分比。

1.2.4 ELISA检测受试者外周血IL-17、IL-23、IL-6

和TGF-β水平 取冻存血浆，复温，按照试剂盒说明书检测其IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平。

1.2.5 FeNO的检测 肺功能检测之前进行患者呼出气一氧化氮(fractional exhaled nitric oxide, FeNO)的检测。

1.2.6 肺功能的检测 应用Medisoft型肺功能仪测定患者肺功能，主要检测指标为第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second， FEV1)/用力肺活量(forced vital capacity， FVC)百分比和第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV1 in predicted, FEV1%pred)。

2 结果

2.1 各组一般资料的比较4组受试者在性别组成、年龄、BMI、吸烟史和易感体质比例等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 各组一般资料的比较

2.2 各组外周血Treg、Th17百分比的比较各组外周血Treg、Th17百分比及Treg/Th17比值比较示差异有统计学意义(均P<0.001)。ACO组、哮喘组及COPD组Treg百分比、Treg/Th17比值显著低于健康组，Th17百分比显著高于健康组(均P<0.05)；其中ACO组Treg百分比、Treg/Th17比值显著低于哮喘组和COPD组，Th17百分比显著高于哮喘组和COPD组(均P<0.05)。(表2、图1)

表2 各组外周血Treg、Th17百分比比较

2.3 各组血浆IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平的比较各组血浆IL-17、IL-6、IL-23、TGF-β水平的比较差异有统计学意义(均P<0.001)。ACO组、哮喘组及COPD组IL-17、IL-23、IL-6和TGF-β水平显著高于健康组(均P<0.05)，其中ACO组IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平显著高于哮喘组和COPD组(均P<0.05)。(表3)

表3 各组血浆IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β水平比较

2.4 各组FeNO和肺功能指标的比较各组FeNO、FEV1/FVC百分比和FEV1%pred的比较差异有统计学意义(均P<0.001)。ACO组、哮喘组和COPD组FeNO显著高于健康组，FEV1/FVC、FEV1%pred显著低于健康组(均P<0.05)；其中ACO组、哮喘组FeNO显著高于COPD组(均P<0.05)，但ACO组FeNO与哮喘组比较差异无统计学意义(P>0.05)；ACO组、COPD组FEV1/FVC、FEV1%pred显著低于哮喘组(均P<0.05)，但ACO组与COPD组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。(表4)

表4 各组FeNO和肺功能指标的比较

2.5 Treg/Th17比值的ROC分析采用ROC分析Treg/Th17比值的诊断效能。结果显示，Treg/Th17对ACO组、COPD组、哮喘组及健康组有一定鉴别能力，其中鉴别ACO组与哮喘组、ACO组与健康组、COPD组与哮喘组、COPD组与健康组的AUC均大于0.850。而鉴别ACO组与COPD组、哮喘组与健康组的能力一般，前者AUC为0.726，敏感度、特异度分别为48.1%、95.6%；后者AUC为0.771，敏感度、特异度分别为88.3%、73.3%。(图2、表5)

图2 Treg/Th17比值的ROC分析

表5 Treg/Th17对ACO、哮喘和COPD的诊断及鉴别诊断效能评估

3 讨论

目前，临床上对ACO尚无明确统一的诊断标准，医生必须详细询问患者病史，反复进行肺功能、实验室及其他辅助检查，作出综合判断，但极易出现误诊、漏诊[10]。气道炎症是ACO发生发展的主要因素之一，而由嗜酸性粒细胞和中性粒细胞共同介导的气道炎症可能是ACO的重要发病机制[11]。

Th17和Treg均属于CD4+T细胞亚群，其在免疫炎症反应中有重要调控作用，这2种细胞的功能相互拮抗，其细胞比例失衡是多种炎症性疾病和自身免疫性疾病发生的主要因素[12]。Huang等[13]研究发现，与健康对照组相比，哮喘患儿存在明显的Treg/Th17失衡，且与疾病的严重程度密切相关。Sun等[14]研究指出，Treg/Th17失衡在COPD的发病机制中发挥重要作用。该研究结果显示，ACO患者Treg/Th17比值显著低于COPD、哮喘患者和健康者，提示ACO患者Treg/Th17失衡最为严重，可能机制是Treg、Th17的分化紊乱加剧了体内炎症细胞激活及炎性因子分泌，加重气道炎症反应。

IL-17是Th17的主要效应因子，可激活T细胞并刺激上皮细胞、内皮细胞等产生多种细胞因子如IL-6、IL-8等，放大炎症反应[15]。IL-6和TGF-β是Th分化中的关键因子，在两者的协同刺激下，活化的Th分化为Th17[16]。IL-23虽不参与Th17分化，但对于维持Th17的存活和增殖有重要作用[17]。Sarinho等[18]观察到IL-6、IL-17水平在慢性持续性哮喘患儿中明显升高，且与患儿疾病严重程度密切相关。曾文等[19]研究发现，COPD患者外周血IL-22、IL-23、IL-12等细胞因子水平较健康人群升高；疾病状态下，Treg/Th17平衡被打破；肺功能指标FEV1与Th17水平呈负相关，与Treg水平呈正相关。该研究发现，ACO患者IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β水平显著高于COPD患者、哮喘患者和健康者，进一步验证了Treg/Th17失衡引起的免疫平衡紊乱可能是ACO病理生理机制之一。此外，ACO组、哮喘组FeNO水平显著高于COPD组，而FEV1/FVC百分比、FEV1%pred显著低于哮喘组。上述结果表明，ACO患者病情更重，气道炎症反应水平更高，这可能是ACO患者兼具喘息症状反复发作和COPD气流受限等临床表现的原因，与史菲[20]的研究结果相似。ACO的气道炎症表现与COPD相似，但该研究结果提示ACO气道炎症反应水平高于COPD，可能还与中性粒细胞、T细胞、嗜酸性粒细胞等的作用有关，后续还有待深入分析。另外，ROC分析提示，Treg/Th17对于ACO、COPD、哮喘患者及健康者具有一定的鉴别能力，其中对ACO与哮喘者、ACO与健康者、COPD与哮喘者、COPD与健康者的诊断价值较高，但对ACO与COPD者、哮喘者与健康者的鉴别能力一般。然而，研究收集的病例数较少，可能存在样本偏倚，后续将募集更多ACO、哮喘及COPD患者，检测其外周血Treg、Th17水平，进一步分析它们的诊断价值。

综上所述，ACO患者存在明显的Treg/Th17失衡，外周血Treg、Th17检测可能有助于ACO、哮喘及COPD的鉴别，初步为ACO的诊断提供参考，后续还需要大样本数据深入验证。