血清TNF表达及TNF-β 252G/A位点多态性与子宫内膜异位症易感性的相关性分析

杨贤慧，方霞，刘爱玲，施俊柱

(1. 深圳市龙华区人民医院 检验科，深圳 518109；2. 深圳市龙华区中心医院 检验科，深圳 518110)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)是指子宫内膜的腺体和/或间质等组织在子宫肌层以外的其他部位生长和浸润所引起的一种育龄妇女常见疾病，发病率10%～15%，可导致妇女痛经、不孕[1-2]。EMT的发病机制至今仍未被阐明，有研究表明，其发病与机体免疫功能异常及有无EMT家属史关系密切，有家属史的人群EMT发病率为无家族史者的6～7倍[3]。TNF是一种具有多种生物活性的细胞因子，通过与其他促血管生成因子相互作用在EMT的发生发展过程中发挥重要作用[4]。TNF基因多态性指TNF及其受体基因片段的部分碱基发生变化，而这些变化与一些自身免疫性疾病患者血清中TNF水平关系密切[5-6]。基因多态性因不同地区和种族人群的遗传背景、生活方式及环境等诸多因素的不同而存在一定差异。因此，研究对深圳地区107例EMT患者和120例健康女性血清TNF水平及TNF-β252G/A位点多态性进行了检测分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象收集2017年5月至2019年3月于深圳市龙华区人民医院就诊的EMT患者107例，同时收集体检健康育龄女性120例为对照，研究对象一般资料如下(表1)。研究对象排除糖尿病、肿瘤、甲状腺功能和肝肾功能不全等疾病及严重营养不良并使用过激素者，同时确保2组研究对象均无血缘关系。该研究经医院医学伦理委员会批准并获得患者及其家属的知情同意签字。

1.2 试剂与仪器全血DNA提取试剂盒，购自亚能生物技术(深圳)有限公司；TNF ELISA测定试剂盒，购自上海森雄科技实业有限公司。AE275全自动酶联免疫分析仪，来自深圳市爱康生物科技有限公司；ABI7500实时荧光定量PCR仪，来自美国应用生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 样本的采集 采集研究对象清晨空腹静脉血4～5 mL，将其中2 mL加入EDTA-K2一次性抗凝管中混匀，用于TNF-β252G/A位点多态性的分析；将剩余样本加入一次性干燥管内，室温静置30 min后离心分离血清用于TNF-α和TNF-β水平的测定。

表1 研究对象一般资料

1.3.2 血清TNF-α和TNF-β水平的测定 ELISA检测研究对象血清TNF-α和TNF-β水平，所有操作严格按照仪器和试剂盒使用说明书及科室SOP操作规程进行，确保同等条件下2组检测结果的准确性和可比性。

1.3.3 全血DNA的提取 采用试剂盒提取全血DNA，所有操作均严格按照试剂盒及仪器使用说明书进行，提取后检测其结构的完整性，确认后采用紫外分光光度计检测其浓度和纯度，合格后于-20 ℃保存备用。

1.3.4TNF-β252G/A位点多态性的分析 检测步骤为(1)引物设计：上游引物为5′-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3′，下游引物为5′-AGAGCTGGTGGGGACATGTCTG-3′；(2)PCR扩增体系：PCR反应物总体积为30 μL，其中包括DNA模板5 μL，2 mmol/L dNTP 2 μL，10×PCR缓冲液4 μL和上、下游引物各0.2 μmol/L及TaqDNA聚合酶2.5 U；(3)PCR扩增程序：94 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s→60 ℃退火30 s→72 ℃ 45 s，共循环30次，最后72 ℃延伸5 min；(4)电泳：取PCR扩增产物25 μL，加入8 U/μL NcoⅠ限制性内切酶10 U，10×酶切缓冲液3 μL，用双蒸水调整溶液体积至30 μL，37 ℃酶切12 h；将溶液加入含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶的负极端孔内，于100 V电泳30 min后取出，分析其基因型。

2 结果

2.1 不同组别研究对象血清TNF水平的比较EMT患者血清TNF-α和TNF-β水平分别为(2.91±1.27) μg/L和(726.08±265.23) ng/L，显著高于对照组的(1.52±0.57) μg/L和(379.42±213.75) ng/L(均P<0.05， 表2)。

表2 不同组别研究对象血清TNF-α和TNF-β水平比较

2.2 不同分期EMT患者血清TNF水平的比较EMT患者血清TNF-α和TNF-β水平随着EMT病情分期的加重而升高，不同分期结果之间的差异有统计学意义(均P<0.05， 表3)。经Spearman相关性分析，TNF-α和TNF-β水平与病情分期呈正相关(r=0.695 4、0.770 5，图1)。

表3 不同分期EMT患者血清TNF水平的比较

2.3 不同组别研究对象血清TNF-β252G/A位点多态性的比较EMT组患者血清AA基因型和A等位基因检出率分别为21.50%和42.52%，显著高于对照组的8.33%和25.42%(均P<0.05，表4)。

图1 TNF水平与EMT疾病分期的相关性

表4 不同组别研究对象血清TNF-β 252G/A 位点多态性的比较

2.4 PCR检测不同组别研究对象血清TNF基因型EMT组和对照组均于555 bp、185 bp及有740 bp处有3条电泳带，其中3条带同时出现的为GA基因型，于555 bp和185 bp处出现2条带的为AA基因型，仅于740 bp处出现1条带的为GG基因型(图2)。

2.5 不同基因型EMT患者血清TNF水平的比较携带TNF-β252G/A位点AA基因型的EMT患者血清TNF-β水平为(915.63±327.51) ng/L，显著高于GA和GG基因型的(632.92±213.75) ng/L和(487.45±170.47) ng/L(P<0.05)，但不同基因型EMT患者血清TNF-α水平的差异无统计学意义(P>0.05)。(表5)

注：1、3、5为EMT组， 2、4、6为对照组。1、2为AA基因型，3、4为GA基因型，5、6为GG基因型。图2 TNF-β 252G/A位点扩增产物电泳结果

表5 不同基因型EMT患者血清TNF水平的比较

3 讨论

EMT是育龄女性较为常见的妇科疾病之一，临床表现多样，主要有痛经、慢性非周期性盆腔痛、性交痛及月经异常，严重者可引起女性不孕[7-8]。有研究发现，不孕女性中EMT患病率为25%～35%，盆腔痛女性中为39%～59%[9]，痛经女性中约为50%[8]。另外， EMT可增加患者自身免疫性疾病、肿瘤、哮喘及炎症性肠病等多种慢性疾病的发病风险[10]，且该病复发率高达20%～40%。同时，EMT具有类似恶性肿瘤的局部种植、浸润生长及远处转移能力，严重影响育龄女性的健康和生活质量。EMT发病机制尚未完全被阐明，有关文献[11]表明，EMT患者一级亲属及单卵双胞胎的发病率较高，约51%的EMT患者发病与遗传因素及某些基因突变所引起的细胞因子异常等有关。因此，探索EMT的发病机制及新的诊断指标对该病的诊断、治疗、预防及降低复发率意义重大。

TNF是机体T细胞分泌的具有多种生物活性的淋巴毒素之一，通过与其相应的受体结合，诱发炎症反应并刺激T、B细胞及胸腺细胞等生长，在抗肿瘤和抗病毒感染中发挥重要作用。有研究表明，EMT患者血清中TNF水平明显升高，且与疾病严重程度、分期正相关[12-13]。该研究结果显示，深圳市龙华区EMT患者血清TNF-α和TNF-β水平显著高于健康对照者(均P<0.05)，这可能与EMT病灶内新生血管形成和盆腔粘连有关，与余鸿标等[13]的报道相一致。而且，相关细胞因子水平随着EMT患者病情严重程度的加重而呈上升趋势，两者呈正相关(r=0.695 4、0.770 5)，不同EMT分期患者TNF-α和TNF-β水平之间差异有统计学意义(均P<0.05)，与余鸿标等[13]的报道存在一定差异，这可能与不同地区研究人群的来源、检测方法及仪器的不同有关，具体原因有待进一步研究。

研究表明，EMT的发病与患者个体的遗传易感性相关。TNF位于HLA-β和HLA-C2之间，与MHC及TNF-α紧密连锁，其中位于TNF第1启动子的TNF-β252G/A位点与限制性内切酶的识别密切相关，最易发生位点突变。研究表明，TNF-β252G/A位点基因突变与EMT的发生发展关系密切[13]。该研究结果显示，深圳市龙华区EMT患者血清中TNF-β252G/A位点AA基因型及A等位基因检出率显著高于健康对照组(P<0.05)，这表明该位点的AA基因型可能是该地区EMT发病的遗传易感基因之一，与余鸿标等[13]的报道相一致，但与车坤兰等[14]的不一致。这可能与不同地区和种族人群的遗传背景、生活习惯及生活环境等诸多因素不同有关。研究结果还显示，携带AA基因型的EMT患者血清中TNF-β水平显著高于其他基因型(均P<0.05)，而不同基因型的EMT患者血清中TNF-α水平无显著差异(P>0.05)，这可能与TNF-β252G/A位点突变主要影响TNF-β水平有关。

综上所述，EMT患者血清TNF-α和TNF-β水平显著高于健康对照组，与病情分期呈正相关，且携带TNF-β252G/A位点的AA基因型EMT患者血清中TNF-β水平显著高于其他基因型，该基因型可能是该区育龄妇女EMT发病的危险基因型之一。但是，单一基因突变在EMT发生和发展中的作用会受不同地区和种族人群的遗传背景、生活环境及饮食习惯等诸多因素的影响而存在一定差异。因此，加强有关不同地区和种族育龄女性血清TNF水平及其基因位点突变的调查分析，对EMT患者的早发现、早诊断、早治疗及早预防具有重要临床意义。