柏树花粉主要致敏蛋白Cup a 1的分离纯化

陈晴，岳诗雨，张晓楠，何韶衡

过敏性疾病被世界卫生组织列为21世纪重点防治的三大疾病之一，是当前世界性的卫生学问题[1]。柏树花粉(Cypresspollen)是引起季节性过敏性疾病最常见的原因之一，国内外对柏树花粉致敏蛋白组分的相关研究报道结果不尽相同[2]。为了减少在主要过敏原水平上引入任何可能的人工制品的风险，开发快速的提取方法，得到主要的过敏原富集物是研究的关键，可对当地过敏性性疾病进行诊断和治疗。本研究使用40 mmol/L NH4HCO3缓冲液作为提取液对柏树花粉致敏蛋白进行粗提取，利用离子交换层析初步纯化其主要致敏蛋白Cup a 1，使用离子交换色谱和SDS-PAGE等方法对辽宁省锦州地区柏树花粉致敏蛋白组分进行分离、鉴定，为本地区花粉过敏的诊断及治疗提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料来源

花粉原料为中国柏树(Cypress)花粉，2017年4月柏树花粉季内于辽宁省锦州市锦州医科大学采集，采集后于-80 ℃冷冻保存。

1.2 主要仪器与试剂

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直电泳槽(Bio-Rad，美国)；AKTA Pure蛋白分离纯化仪(GE，美国)；Azure C300化学发光成像系统(Azure，美国)；Micro17R台式冷冻离心机(Thermo，美国); Cascada Ⅲ 全新智能纯水/超纯水一体化系统(Pall，美国)；甘氨酸、四甲基乙二胺(TEMED)、过硫酸铵(APS)、丙烯酰胺、N, N-亚甲基二丙烯酰胺、考马斯亮蓝R-250、KH2PO4、NH4HCO3和十二烷基硫酸钠(SDS)(国药集团，上海，中国)；蛋白相对分子质量标准(Takara生物技术有限公司，大连，中国)。

1.3 柏树花粉粗提液提取

称量柏树花粉1.00 g，用20 mL 4 ℃ 10 mmol/L KH2PO4快速清洗，5 000×g离心除去上清液，将花粉沉淀转移至陶瓷研钵，加入液氮快速研磨，加入20 mL 40 mmol/L NH4HCO3缓冲液将花粉转移至50 mL烧杯中，4 ℃下搅拌过夜，在4 ℃下，20 000×g离心花粉混悬液30 min，保留上清，用0.45 μm滤器过滤上清，4 ℃保存[2]。

1.4 柏树花粉致敏蛋白Cup a 1分离纯化

结合液A：40 mmol/L NH4HCO3，洗脱液B：1 000 mmol/L NH4HCO3。首先用20%乙醇清洗系统泵，然后将离子交换层析柱HiTrap Q HP (1 mL，GE Healthcare)柱子连接到AKTA pure仪器上，再用结合液A清洗样品泵。然后用5个柱体积 A平衡柱子。通过样品泵上样，使用20% B冲洗3个柱体积，洗去未结合的蛋白质，逐渐增加洗脱液B浓度40%，冲洗3个柱体积，同时收集洗脱液，最后增加洗脱液B浓度80%。

1.5 纯化后柏树花粉致敏蛋白Cup a 1鉴定

采用SDS-PAGE体系对各组分蛋白进行分析鉴定。12%分离胶和5%浓缩胶对柏树花粉粗提液和经离子交换层析分离后每一份蛋白组分进行电泳分离，电泳凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液进行染色，脱色和用凝胶电泳成像系统分析并进行图像采集，与蛋白质标准比对后确定蛋白质的相对分子质量。

2 结果

2.1 柏树花粉粗提液的SDS-PAGE

柏树花粉粗提液中主要有20余条蛋白区带，主带有6条，相对分子质量分别为70 000、45 000、43 000、36 000、24 000、17 000, 其中43 000为柏树花粉中的主要过敏原蛋白质。在25 000～100 000和10 000～17 000区带内的蛋白含量相对丰富(图1)。

2.2 Cup a 1的分离纯化

2.2.1 柏树花粉粗提液的离子交换层析

阳离子交换层析结果见图2，其中Ⅲ为含目的蛋白Cup a 1的收集峰。

图 1 柏树花粉粗提液中主要蛋白质分布Fig 1 SDS-PAGE of major proteins in crude extract of Cypress pollenMr:相对分子质量；M：蛋白marker；1：40 mmol/L NH4HCO3缓冲液作为提取液

图 2 阳离子交换层析色谱结果Fig 2 Result of cation exchange column chromatography

2.2.2 SDS-PAGE鉴定

选择图2中标注的5个收集液进行SDS-PAGE分析(图3)，其中Lane 3对应的Ⅲ收集液SDS-PAGE可见明显相对分子质量为43 000蛋白条带，即目的蛋白Cup a 1。

图 3 阳离子交换层析SDS-PAGE结果Fig 3 SDS-PAGE results of cation exchange column chromatographyMr:相对分子质量；1～5分别对应Ⅰ～Ⅴ号收集液的蛋白条带

3 讨论

花粉过敏(pollen allergy)又称枯草热(pollinosis)，是致敏花粉所引起的鼻黏膜炎症、过敏性哮喘和过敏性结膜炎等症状[3-4]。

柏科植物(Cupressaceae)在国内外分布都极为广泛，1945年最早报道人类对柏树花粉过敏，在北美和澳大利亚，它们是造成呼吸道过敏非常重要的原因[5]。柏科花粉过敏症的临床数据和流行病学数据因物种和地区而有所不同。在不同种类的柏科植物系家族中，地中海柏木亚科类植物占很大一部分，并且已经被确认为是冬季过敏症与日俱增的“元凶”[6]。在日本主要的花粉过敏源是日本雪松(日本柳杉)(Japanese cedar)[5]。在中国，柏树花粉是北部沿海地区春季主要致敏花粉[7]。据报道，3月份北京协和医院的花粉过敏患者中，60%由柏树花粉引发，圆柏(Chinese juniper)是目前北京地区3～4月上旬造成过敏性鼻炎和结膜炎最主要的原因[8]。冬季周期性频发的鼻炎对抗生素疗法无响应证明了临床现象也很大程度上表现为柏树过敏症[9]。

柏树花粉中主要的致敏成分是蛋白质，对柏树花粉过敏性提取物的表征表明，该花粉至少含有6种对IgE反应的成分，主要为相对分子质量43 000的糖蛋白(Cup a 1)[10]。与高碳水化合物含量相比，这些提取物中的蛋白质含量非常低。因此，碳水化合物部分在花粉提取物中的作用是一个重要的问题，糖基可参与人IgE的结合，可能是提取物之间广泛交叉反应的原因[11-12]。柏树花粉提取物目前被应用于柏科花粉病的诊断和免疫疗法，然而，商业化用于体外检测的试剂盒常常对有症状的患者提供不明确或假阴性的结果，因此有必要对柏树花粉的主要过敏原进行分离纯化，以实现对花粉过敏患者特异性的诊断与治疗[12-13]。

本研究通过对柏树花粉粗提液中主要致敏蛋白Cup a 1分离纯化，使用40 mmol/L NH4HCO3缓冲液作为提取液对柏树花粉致敏蛋白进行粗提取，利用离子交换层析初步纯化。结果表明，使用40 mmol/L NH4HCO3进行提取时，粗提液中Cup a 1含量最高(相对分子质量43 000)，而其他蛋白含量较少，通过利用酸性缓冲溶液10 mmol/L KH2PO4(pH 4.3)溶液对花粉进行快速清洗，溶解花粉中的碳水化合物，再利用碱性缓冲液40 mmol/L NH4HCO3(pH 8.0)作为提取液进行提取过程，免除了脱盐、透析和冷冻干燥等繁琐过程，避免了蛋白质的降解，其碱性低盐的成分可以提取少量的蛋白质，其中过敏原蛋白为提取液的主要蛋白成分。阳离子交换层析结果，主要致敏原蛋白Cup a 1主要分布在Ⅲ峰，经SDS-PAGE分析，与国内外报道的Cup a 1相对分子质量43 000[2]相一致。纯化后的Cup a 1具有应用于制备过敏原皮试液或脱敏制剂和提高柏树花粉皮试阳性率及脱敏疗效的潜在价值，还有望开发成体外检测试剂，为临床柏树花粉变态反应的诊断和治疗奠定基础。本研究利用离子交换层析对柏树花粉粗提液进行分离，成功纯化出柏树花粉主要致敏蛋白Cup a 1。