菲并咪唑-呋喃化合物水相体系的光谱行为及增强型Fe3+荧光识别

杜佳慧，阚伟，赵冰，尹浩纯，王丽艳，宋波，孙立

(齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

铁是人体中必需的微量元素之一[1]，人体内铁离子缺乏会导致缺铁性贫血[2]，但过量铁离子会引起各种疾病，如心脏、肝脏疾病、糖尿病、部分肿瘤等[3]。因此对铁离子进行定性和定量检测具有非常重要的意义。常见的铁离子检测方法主要有分光光度法[4]、原子吸收法[5]、比色法[6]、电化学法[7]和荧光光谱法[8-9]等。其中，荧光光谱法具有选择性好、抗干扰强、灵敏度高、可实时监测、可与荧光显微成像技术结合、实现细胞或活体中对目标分析物的定位检测等优点。因此，荧光光谱法在生物监测和环境检测等方面具有良好的应用前景。荧光光谱法基于发光团在激发态下发射波长及发射强度的变化特征实现对客体物质的定性和定量分析。根据发射强度的变化荧光探针分别增强型和淬灭型2种。从荧光检测效果来看，增强型荧光探针在荧光检测方面具有更好的实际应用价值。由于铁本身的顺磁性特征，大多数铁离子荧光探针表现为淬灭型[10-12]。2013年，文献报道了萘胺衍生物[13]通过荧光增强识别Fe3+，但识别过程和识别效果仍在有机溶剂中进行。Chen课题组[14]报道了一列苯并噻唑-吡啶衍生物在水相体系中的Fe3+增强型荧光探针，可用于活体细胞中Fe3+检测。最近，Xu课题组[15]报道了一个近红外的增强型Fe3+检出限荧光探针，并成功地实现了活体细胞成像，但是该探针同时对Al3+表现为荧光增强。

虽然有文献报道具有荧光增强效果的Fe3+探针，但是增强型Fe3+探针的结构类型较少，对增强型发光机制的解释尚不明确。因此设计开发结构多样、灵敏度高、易操作、不易受干扰的增强型Fe3+探针，研究和讨论其增强机制、拓展增强型Fe3+荧光探针的应用具有非常重要的研究意义。本课题组在前期Fe3+荧光探针的研究基础上[16-18]，选取菲并咪唑作为荧光基团、亚胺键作为连接基团、呋喃环作为识别基团设计了一种基于菲并咪唑-呋喃的荧光探针PIPF，通过对紫外和荧光光谱的变化研究了该化合物水相体系的光谱行为及其对金属离子的识别行为。结果发现探针PIPF可以对Fe3+实现选择性识别，表现为荧光增强，并能通过荧光增强效果实现现实水样中的Fe3+浓度的检测。探针PIPF合成路线如下：

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

菲醌、水杨醛、呋喃、硝基苯甲醛、N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，AR，上海阿拉丁试剂公司；乙酸铵，AR，天津市天达净化材料精细化工厂；冰乙酸、乙酸乙酯，AR，天津市富宇精细化工有限公司；石油醚，AR，天津市天力化工有限公司；DMF，AR，天津市科密欧化学品公司购买。

X-6精细显微熔点测试仪，北京泰克仪器有限公司；Spectrum GX型傅里叶变换红外光谱仪，美国珀金埃尔默公司；2400-IICHNS/O元素分析仪，美国珀金埃尔默公司；UV-Vis TU-1901型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器公司；LS-55型荧光分光光度计，美国Perkin Elmer公司；Bruker AVANCE-600核磁共振波谱仪，德国布鲁克科技有限公司。

1.2 合成及表征

1.2.1 中间体的合成

2-(3-氨基苯基)-1H-菲并[9, 10-d]咪唑(1)按照文献[19]报道的方法合成。

1.2.2 探针的合成

依次向50 mL 三口烧瓶中加入2-(3-氨基苯基)-1H-菲并[9, 10-d]咪唑(1)1.55 g(5.0 mmol)、呋喃-2-甲醛(2)0.40 mL(5.0 mmol)和乙醇20 mL，常温搅拌。反应过程中采用TLC(展开剂石油醚/乙酸乙酯体积比为1∶1)跟踪反应进程，约2 h后反应结束。向产物中加入蒸馏水，用质量分数为40%的NaOH溶液调节pH值至7.4左右，有固体析出。抽滤，滤饼用乙醇洗涤5次，收集滤饼并干燥，得到粗产物，粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到固体粉末状探针PIPF，1.74 g，产率为90%。m.p. 230～231 ℃；1H NMR(600 MHz, DMSO-d6) δ: 6.78(d,J=7.20 Hz, H, ArH), 7.27 (d,J=3.00 Hz, H, ArH), 7.40(d,J=7.80 Hz, 1H, ArH), 7.62～7.78(m, 3H, ArH), 7.72～7.78(m, 2H, ArH), 8.21(d,J=7.20 Hz, 2H, ArH), 8.03(s, 1H, N=CH), 8.21(d,J=7.20 Hz, 1H, ArH), 8.57(d,J=7.80 Hz, 1H, ArH), 8.61 (d,J=7.80 Hz, 1H, ArH), 8.63(s, 1H, ArH), 8.86(d,J=8.40 Hz, 1H, ArH), 8.89(d,J=8.40 Hz, 1H, ArH), 13.50(s, 1H, NH)。13C NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ: 152.4, 152.4, 148.5, 149.2, 147.3, 137.5, 131.9, 130.5, 128.2, 128.2, 128.0, 127.7, 127.6, 127.4, 125.9, 125.7, 124.7, 124.3, 122.9, 122.5, 122.4, 121.9, 119.3, 118.0, 113.2. IR(KBr) ν: 3 424, 1 677, 1 635, 1 579, 1 517, 1 444 cm-1。

1.3 光谱性能测试

1.3.1 储备液的配制

称取化合物PIPF 0.003 9 g(1 mmol)，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)定容，得到浓度为1.0×10-4mol/L 的荧光探针PIPF储备液。称取0.000 6 g的N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，用蒸馏水定容，配成0.01 mol/L HEPES溶液，摇匀静置，用氢氧化钠溶液调成pH值为7.4缓冲溶液。称取相应质量(1 mmol)的硝酸盐，用0.01 mol/L的HEPES(pH=7.4)缓冲溶液定容，配置浓度为0.1 mol/L的金属阳离子储备液。

1.3.2 光谱性能测试

分别测定不同含水量，(0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%)的DMF和HEPES(pH=7.40)混合溶液的紫外可见吸收光谱和荧光发射谱，探针浓度为1.0×10-5mol/L。

在探针PIPF与金属离子的识别性能测试中，荧光探针PIPF测试溶液浓度为1.0×10-5mol/L，金属离子浓度为5.0×10-5mol/L，测试体系为V(DMF)∶V(HEPES)=9∶1，pH=7.4；金属离子浓度滴定测试采用的金属离子浓度为0～5.0×10-5mol/L。荧光光谱测试的激发波长为341 nm，激发和发射的狭缝分别为5 nm和15 nm。

1.3.3 水样测试

将过滤漂浮物和沉淀等杂质的自来水、瓶装水(哇哈哈公司)、齐齐哈尔劳动湖水和嫩江水(齐齐哈尔段)作为待测水样，然后采用HEPES溶液(pH=7.4)稀释100倍后加入荧光探针PIPF(1.0×10-5mol/L)及不同浓度Fe3+，发射波长为400 nm时荧光强度，并用标准加入法进行回收实验。

2 结果与讨论

2.1 荧光探针PIPF在水相体系中的光谱行为

呋喃修饰的菲并咪唑衍生物在极性有机溶剂中具有良好的溶解性，为了拓展探针在水相体系中的应用范围，考察了荧光探针PIPF在不同体积比的DMF/H2O(0.01 mol/L HEPES，pH=7.4)混合溶剂中紫外吸收光谱和荧光发射光谱的变化情况。如图1(a)所示，荧光探针PIPF在纯DMF溶剂(1.0×10-5mol/L)中有3个吸收带，吸收波长分别为313、341和359 nm，3个吸收带是由于芳香环的π→π*跃迁和C=N键的n→π*跃迁引起的。逐渐向探针DMF溶液中加水，3个吸收带的吸收波长逐渐红移，吸光度逐渐增加，且吸收带均逐渐变宽。当含水量达到90%时，3个吸收峰分别红移至330、348和366 nm，波长变化分别为17、7和7 nm。这种紫外光谱红移和吸收峰变宽的现象是由于探针分子在水相体系中溶解度逐渐变小，探针分子在水相中逐渐聚集，导致光谱红移和变宽[20]。

探针溶液随含水量变化的荧光光谱变化情况如图1(b)所示 (激发波长341 nm)。在纯DMF溶剂中，探针在400 nm处几乎不发射荧光，探针分子在激发态分子自由转动进而引起非辐射跃迁(IR)导致了荧光的弱发射[21]。随着探针溶液中水含量的逐渐增加，荧光强度也逐渐增加。含水量达到50%时，体系的荧光强度达到最高，荧光强度增强为是纯DMF溶液的23倍。含水量增加到60%时，探针的荧光强度基本保持不变。当水和DMF的比例增加到70%时，探针的荧光强度为出现明显的淬灭现象；含水量继续增加，荧光强度继续下降，含水量达到90%时，荧光强度淬灭到最低，与纯DMF溶液的强度相当。探针分子的荧光强度随含水量的增加先增强后淬灭，说明了探针分子在水溶液形成了聚集，不同的聚集状态导致了不同的荧光状态。随含水量增加，探针分子的聚集限制了其在水溶液中的自由旋转，激发态能量全部用于发射荧光，导致荧光增强，这是典型的聚集诱导发光(AIE) 现象[22]。含水量继续增加，探针分子的聚集加剧，溶液中探针分子浓度下降，导致溶液的荧光强度下降，这是典型的聚集荧光淬灭 (ACQ) 现象[23]。

图1 不同含水量条件下探针的吸收和发射光谱

2.2 探针PIPF在水相体系中的识别行为

为了考察探针在水相体系下中识别行为，在探针分子的低荧光状态下(V(DMF)∶V(HEPES)=9∶1，pH=7.4)，研究了探针分子在水相体系中对金属离子的识别行为。

2.2.1 探针PIPF与不同金属离子的识别作用

图2(a)为探针PIPF(1.0×10-5mol/L)在不同金属离子(Al3+、Zn2+、Ag+、Cu2+、Ca2+、Hg2+、Mg2+、Pb2+、Na+、Ba2+、Ni2+、K+、Cr3+、Fe3+、Co2+和Cd2+，5.0×10-5mol/L)存在下的紫外吸收光谱。Cu2+存在时，3个吸收峰的吸光度轻微降低；Hg2+的加入，3个吸收峰的吸光度轻微增加；而Fe3+存在时，探针在313 nm处的吸收峰出现了显著的蓝移，341 nm处的吸收峰明显变弱，359 nm处的吸收峰没有明显变化。其他金属离子存在时，探针的紫外吸光度没有发生明显的变化。从紫外光谱中初步推断，探针PIPF可能对Cu2+、Hg2+和Fe3+具有识别作用。

图2 不同金属离子存在下探针的紫外和荧光光谱

为了进一步确定探针对金属离子的识别作用，在同样条件下(1.0×10-5mol/L，V(DMF)∶V(HEPES)=9∶1，pH=7.4)考察了探针PIPF与上述16种不同金属离子(5.0×10-5mol/L)存在时的荧光发射情况[图2(b)]。以325 nm为激发波长，Fe3+的存在显著激发了探针在400 nm处的荧光强度，荧光强度增强了11.4 倍。探针溶液中加入Al3+时，探针的荧光强度增强幅度较小，增强倍数约4倍左右。探针与其他金属离子共存时，荧光光谱没有发生明显的变化。从紫外和荧光光谱的结果看出，探针对Fe3+具有一定的识别作用。

2.2.2 探针PIPF识别Fe3+的选择性

高选择性识别是衡量探针识别性能的重要指标之一。探针PIPF(1.0×10-5mol/L)与过量的干扰离子(5.0×10-5mol/L)存在下，加入当量的Fe3+(1.0×10-5mol/L)之后探针的荧光光谱变化如图3所示。除Ca2+外，14种过量的干扰离子存在下，当量的Fe3+仍然有能力使探针的荧光强度增强到Fe3+单独存在时的荧光强度，说明其他14种金属离子对探针识别Fe3+没有干扰。然而过量的Ca2+存在时，探针的荧光强度保持着低荧光状态，没有实现荧光增强特性，这说明Ca2+对探针识别Fe3+具有一定的干扰性。接着，在探针溶液中先加入当量的Fe3+再加入过量的Ca2+，探针的荧光强度先增加后淬灭，说明先后加入Fe3+和Ca2+能够实现探针off-on-off识别功能。

图3 干扰离子存在下探针识别Fe3+的荧光光谱

同样，考察了pH值变化对探针PIPF识别Fe3+的影响。体系的pH值在3.0～10.0之间变化时(V(DMF)∶V(HEPES)=9∶1)，探针PIPF加入Fe3+前后荧光强度变化情况如图4所示。

图4 探针PIPF和PIPF-Fe3+络合物随pH值变化的荧光强度变化

探针PIPF单独存在时，在酸性条件下(pH=3.0～6.0)，荧光强度保持较高状态，可能是由于酸性条件下呋喃上的O原子被质子化，形成了分子内的光诱导电荷转移(ICT)作用，导致酸性条件下探针PIPF具有较高的荧光强度。当溶液的pH值逐渐接近中性，呋喃上的O原子逐渐恢复孤对电子状态，此时探针PIPF激发态下形成光诱导电子转移(PET)过程，表现为较弱的荧光强度。随着溶液碱性的继续增加，探针PIPF的荧光强度继续下降，pH值在10.0左右荧光强度下降到最低。探针PIPF溶液加入Fe3+之后，在pH值测试范围内(3.0～10.0)，荧光强度一直保持中等强度状态，pH值的变化对探针PIPF识别Fe3+没有干扰，也就是说探针PIPF识别Fe3+不受pH值变化的影响。

2.2.3 探针PIPF识别Fe3+的灵敏性

在V(DMF)∶V(HEPES)=9∶1(pH=7.4)体系下，通过Fe3+浓度滴定确定探针PIPF识别Fe3+的定量关系。向探针溶液中不断加入Fe3+(0～1.0×10-4mol/L)，探针PIPF(1×10-5mol/L)随Fe3+浓度变化的荧光发射光谱如图5(a)所示。

图5 (a)探针随Fe3+浓度变化的荧光光谱；(b)探针随Fe3+浓度变化的荧光变化曲线；插图：荧光变化随Fe3+浓度变化的线性关系

从图中看出，加入的Fe3+浓度较低时，探针的荧光强度变化不明显，当Fe3+浓度达到时20 μmol/L时，探针PIPF的荧光强度开始增加，此后随着Fe3+浓度的增加荧光强度逐渐增强，Fe3+浓度达到100 μmol/L时荧光强度达到最大。图5(b)清晰地看出Fe3+浓度在20 μM以后探针荧光强度变化情况。图5(b)插图表明，Fe3+浓度在30～90 μmol/L范围内，探针荧光强度的变化随Fe3+浓度变化呈良好的线性关系，滴定数据计算出斜率R2=0.991 7，线性方程为y=0.907 8x-0.142 1。通过公式LOD=3N/S计算的得出探针识别Fe3+的最低检测限为33.05 nmol/L，该检出限值低于人体中血清Fe3+浓度(10～32 μmol/L)。上述结果不仅说明了探针识别Fe3+具有较好的灵敏性，而且能够实现探针对Fe3+的定量识别。

2.3 探针PIPF的识别机制

通过Job法[24]考察了探针PIPF与Fe3+之间的络合情况，结果如图6所示。图6中摩尔分数x约为5，说明探针PIPF与Fe3+形成化学计量比为1∶1的PIPF-Fe3+络合物。

图6 探针PIPF识别Fe3+的Job’s曲线

在此基础上，建议了探针PIPF水相体系中识别Fe3+时的荧光变化机制(图7)。探针单独存在时，呋喃环上O原子的孤对电子在激发态下发生光诱导电子转移(PET)过程，使探针PIPF本身的荧光强度较弱。Fe3+存在时，探针PIPF与Fe3+形成化学计量比为1∶1的PIPF-Fe3+络合物，此时呋喃环上O原子的孤对电子用于Fe3+的配位。激发态下，孤对电子PET过程被阻断，使得探针发射出一定强度的荧光。因此，实现了探针PIPF荧光增强型Fe3+识别。

图7 探针PIPF识别Fe3+的荧光响应

2.4 水样中Fe3+浓度的检测

为了验证探针PIPF检测Fe3+的实际应用能力，以自来水、瓶装水(哇哈哈公司)作为待测水样，通过荧光光谱测定了水样中Fe3+浓度。所取水样经过滤漂浮物和沉淀杂质，然后采用HEPES溶液(pH=7.4)稀释100倍后加入探针PIPF及不同量的Fe3+，在400 nm处记录荧光信号。测定完毕后，用标准加入法进行回收实验，测定结果平行测定3次如表1所示。水样中Fe3+的回收率在95.0%～102.0%。结果表明探针PIPF可用于水样中Fe3+的定量检测，并具有较高的准确度和精密度。

表1 探针PIPF对不同水样中Fe3+浓度的检测结果

3 结 论

设计并合成了一种菲并咪唑-呋喃化合物PIPF，该化合物在水相介质中对Fe3+表现为荧光增强型荧光探针。探针PIPF溶液随着含水量的增加，聚集程度逐渐增强，荧光强度先增强后淬灭。在V(DMF)∶V(HEPES)=9∶1，pH=7.4体系中，探针PIPF识别Fe3+具有较好的选择性和灵敏性，并形成了化学计量比为1∶1的PIPF-Fe3+配位络合物。探针PIPF识别Fe3+之后PET机制受阻，实现荧光增强型识别功能。探针PIPF识别Fe3+的检出限为33.05 nmol/L，成功实现了实际水样中Fe3+浓度的定量检测。