猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和3型三重PCR检测方法的建立

崔建涛,侯承尧,党钰茗,徐 通,赵 宇,田润博,陈红英* (.河南农业大学 牧医工程学院,河南 郑州 45000；.河南泌阳县农业科学研究所，河南 泌阳 463700)

伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)属于疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科，可以感染各个年龄段猪，引起生长猪呼吸系统疾病、妊娠母猪繁殖障碍、仔猪神经症状并导致高死亡率，特别是15日龄内仔猪，死亡率高达100%[1]。20世纪70年代，我国从匈牙利引入PRV弱毒疫苗Bartha-K61株，该疫苗在1990—2011年间广泛应用，有效控制了猪伪狂犬病在我国的流行。然而，2011年底，我国大部分地区包括接种Bartha-K61疫苗的猪群大规模暴发猪伪狂犬病，给我国养猪业带来了巨大的经济损失[2]。

猪圆环病毒(porcine circovious,PCV)是目前发现的最小的动物病毒，包括PCV1、PCV2和PCV3三种基因型，其中PCV1对猪群没有致病性[3]，断奶后多系统衰竭综合征主要由PCV2引起，同时也会侵害猪的淋巴系统，造成免疫抑制[4]。2016年，美国PALINSKI等[5]和PHAN等[6]几乎同时发现PCV3，PCV3与PCV密切相关，患病仔猪表现多方面功能紊乱，导致母猪死亡和流产。

由于PRV、PCV2和PCV3均可引起母猪繁殖障碍和呼吸系统疾病，临床上很难区分这3种病毒是单一感染还是混合感染，有报道称PRV、PCV2与PCV3同时感染猪群时，临床表现变得复杂且病猪死亡率增加[7-8]。本试验建立能够同时检测PRV、PCV2和PCV3的三重PCR方法，为这3种疾病的防控提供灵敏、特异和准确的诊断方法。

1 材料与方法

1.1 病毒株和临床样品PRV强毒株(PRV HN2012)、PCV2、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)均由郑州市猪重大疫病防控重点实验室保存。对本实验室保存的病料样品进行PCR扩增并测序，鉴定为PCV3阳性病料样品作为阳性对照。

2015年1月-2019年12月间，从河南、河北和山西等地多个猪场患有母猪繁殖障碍或/和呼吸系统疾病的猪中采集74份临床组织样品(包含心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结和脑)。

1.2 主要试剂病毒DNA快速纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Trizol和反转录试剂均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；2×Ftaq PCR Master Mix购自北京庄盟国际生物科技有限公司；二甲基亚砜(DMSO)购自北京索莱宝科技有限公司；pMD18®-T载体、X-gal、IPTG、琼脂糖等均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计与合成从GenBank中下载PRV gE基因序列(KF042383、KF017615、KF130880)、PCV2全基因(HQ395054、KX828217、MF616426)和PCV3全基因(KX778720、KX966193、MK340753)，利用Meg Align(DNA Star)软件进行同源性分析，找出高度保守区域。应用引物设计软件Primer 5.0，设计3对特异性引物，预期扩增片段长度分别为PRV 429 bp、PCV2 273 bp和PCV3 344 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

表1 三重PCR引物序列

1.4 病毒核酸的提取按照Trizol说明书提取PRRSV、CSFV、PEDV和TGEV的总RNA，按照反转录试剂说明书将其反转录为cDNA，于-80℃保存备用；根据病毒DNA快速纯化试剂盒说明书，分别进行PRV、PCV2、PCV3和PPV的DNA提取，于-80℃保存备用。

1.5 PRV、PCV2和PCV3质粒标准品制备利用引物对PRVF/R、PCV2F/R和PCV3F/R分别进行PRV、PCV2和PCV3单项PCR扩增。反应体系为：2×Ftaq Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各为0.5 μL，模板量为1 μL。反应程序为:95℃ 5 min；94℃ 30 s、56℃ 25 s、72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接至pMD18-T载体、构建重组质粒pMD18-PRV、pMD18-PCV2和pMD18-PCV3，经PCR鉴定、测序加以验证。利用紫外分光光度计检测3种阳性质粒浓度，分别计算其拷贝数。

1.6 PRV、PCV2和PCV3三重PCR的建立

1.6.1三重PCR方法反应条件的优化 通过对退火温度(52～62℃)、3种引物比例、DMSO的加入量进行优化，优化的方法是控制变量法，在其他因素均保持不变的条件下，对某一因素的反应条件进行优化，最终确定三重PCR的最佳反应条件。

1.6.2三重PCR方法的特异性试验 应用优化后的三重PCR方法，以PRV、PCV2、PCV3、PPV、PRRSV、PEDV、TGEV、CSFV的DNA或cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测该方法的特异性。

1.6.3三重PCR方法的灵敏度试验 将构建好的阳性质粒pMD18-PRV、pMD18-PCV2和pMD18-PCV3等体积混合后进行10倍系列稀释，并将各个稀释度的标准质粒作为模板通过已优化条件的三重PCR方法进行扩增，以检测该方法的灵敏度。

1.6.4三重PCR方法的重复性试验 对采自不同地区的同时感染PRV、PCV2和PCV3的5份阳性病料样品DNA进行三重PCR检测，并做3次重复。以确定该检测方法的重复性与可靠性。

1.7 临床样品的检测用建立的三重PCR方法检测2015—2019年采自河南、河北和山西等地部分猪场患有母猪繁殖障碍或/和呼吸系统疾病的74份临床组织样品，并与单项PCR检测方法比较，以确定该方法的准确性。

2 结果

2.1 三重PCR，双重PCR及单项 PCR扩增结果及优化通过对反应体系和扩增条件的优化，最终确定三重PCR的反应体系为25 μL。2×Ftaq Master Mix 12.5 μL，ddH2O 5.5 μL，DMSO 1 μL，PRV、PCV2和PCV3上、下游引物均为0.5 μL(25 μmol/L)，PRV、PCV2和PCV3的混合DNA为3 μL。三重PCR的反应程序为:95℃ 5 min；95℃ 30 s、56℃ 25 s、72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 10 min。

单项PCR的反应产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，分别在400、250和350 bp附近有1条特异性条带(图1)，与预期扩增片段大小相符。将回收的PCR产物分别连接到载体pMD18-T进行测序，所测的序列与GenBank上的参考序列比对，其同源性在98%以上，表明PCR产物为PRV、PCV2和PCV3的特异的目的片段。

M.DL2000 DNA Marker;1.PRV、PCV2和PCV3混合模板扩增结果;2.PCV2和PCV3混合模板扩增结果;3.PCV2和PRV混合模板扩增结果;4.PCV3和PRV混合模板扩增结果;5～7.PCV2、PCV3和PRV扩增结果;8～14.阴性对照

2.2 三重PCR特异性结果以建立的三重PCR方法对PRV、PCV2、PCV3、PPV、PRRSV、PEDV、TGEV和CSFV核酸进行PCR扩增，电泳结果显示，能扩增出PRV的429 bp片段、PCV2的273 bp片段和PCV3的344 bp片段，而其他猪病原核酸以及阴性对照均无特异性条带，表明该方法具有良好的特异性(图2)。

M.DL2000 DNA Marker;1.PRV、PCV2和PCV3三重PCR扩增结果;2～7.PEDV、TGEV、PRRSV、PPV、CSFV、E.coli扩增结果;8、9.阴性对照

2.3 三重PCR灵敏度结果经紫外分光光度计分别检测标准质粒pMD18-PRV、pMD18-PCV2和pMD18-PCV3浓度，经计算分别为1.25×1010、6.93×1011和9.12×1010拷贝/μL。将标准质粒等体积混合并进行10倍稀释后进行三重PCR扩增，同时设立阴性对照。结果显示，PRV、PCV2和PCV3的最低检测值分别为1 250.0，693.0和91.2拷贝/μL，表明该方法具有良好的灵敏性(图3)。

M.DL2000 DNA Marker;1～10.PRV、PCV2和PCV3混合质粒稀释10-1 ～10-10后扩增结果；11.阴性对照

2.4 三重PCR重复性试验结果通过已建立的三重PCR方法对采自不同地区同时感染PRV、PCV2和PCV3的5份阳性病料样品DNA进行三重PCR检测，并做3次重复，每次PCR扩增结果均为PRV、PCV2和PCV3阳性，阴性对照无条带，表明该方法具有良好可重复性。

2.5 临床诊断结果应用建立的三重 PCR 方法，对74份临床样品进行检测。结果显示，三重PCR与单项PCR检测符合率为100%，其中PRV、PCV2和PCV3各检出22、53和43份，其检出率分别为29.73%(22/74)、71.62%(53/74)和58.11%(43/74)(表2)，同时感染PRV和PCV2为19份，其检出率为25.69%(19/74)，同时感染PRV和PCV3为16份，其检出率为21.62%(16/74)，同时感染PCV2和PCV3为33份，其检出率为44.59%(33/74)，同时感染PRV、PCV2和PCV3为12份，其检出率为16.22%(12/74)，表明在患有母猪繁殖障碍或/和呼吸系统疾病的样品中存在PRV、PCV2和PCV3(表2)。

表2 不同年份临床样品检出率 %

3 讨论

自2011年底以来，猪伪狂犬病的再次暴发已严重影响我国养猪业的发展[2]。随后，我国政府在2012年提出PRV根除计划。自2013年后，PRV感染率持续下降[9]，但是目前猪伪狂犬病仍然在我国大多数省份流行，且各个地区PRV阳性检出率存在一定差异[10]。尽管有的地区PRV感染率处于较低水平，但是仍未达到根除。我国猪群中PCV2感染情况也不容乐观，李婧雅等[11]对浙江地区的142份病料进行PCR检测,其检出率为56.3%,表明浙江地区的PCV2感染已相当严重。自PCV3被发现以来，PCV3在世界范围内逐渐流行，并在我国多个省份多个猪场存在[7-8,12]。此外，以前研究报道猪群中存在PRV、PCV2与PCV3同时感染[7-8]，且PRV、PCV2和PCV3都是猪场常见病原体，影响着我国养猪业的健康发展。

多重PCR方法于1988年提出[13]，并用于混合感染的鉴别诊断，该方法具有独特的优势和很好的应用价值。多重PCR不仅具有单项PCR所具有的特异性和敏感性，还能缩短检测时间，节省试剂的用量。影响PCR扩增效率的因素有很多，其中引物对于PCR扩增的敏感性和特异性至关重要。本试验为确保PCR反应的特异性，分别选择了PRV的gE基因、PCV2和PCV3的Rep基因，并针对其保守序列设计了3对特异性的引物，扩增的目的片段大小分别为429、273和344 bp，相邻病原体的片段大小相差约80 bp，具有一定的长度梯度，凝胶电泳时能够较直观的区分不同的病原体。另外，PRV基因组G+C含量高达73%左右[14]，PCR中变性温度较高，很难与其他病毒在同一条件进行普通PCR反应，有研究表明PCR扩增体系中加入DMSO，可显著提高PCR扩增的特异性和扩增效率[15]，因此本研究在其反应体系中加入适量DMSO，降低了核酸链的Tm值，使其容易变性，解决了因GC含量过高,不能正常扩增出PRV野毒株gE基因的问题，也不影响普通模板的扩增，使反应更容易进行。

特异性试验结果表明，只有PRV、PCV2和PCV3的三重PCR产物出现目的条带，其他猪病原核酸(PPV、PRRSV、PEDV、TGEV、CSFV)均无条带，表明该方法的特异性较高。灵敏度试验结果表明，PRV的最低检测限为1 250拷贝/μL，与吴旭锦等[16]建立的PRV套式PCR方法灵敏度相当。PCV2的最低检测限为693拷贝/μL，与杨宗照等[17]所建立的多重PCR方法的灵敏度基本一致，PCV3的最低检测限为91.2拷贝/μL，与徐朋丽等[18]所建立的普通PCR方法以及郝占武等[19]建立的PCV3 qPCR方法检测下线相当。试验结果还显示该三重PCR方法重复性好，且与单项PCR检测符合率为100%。表明所建立的三重PCR具有准确、灵敏和特异特点，能为PRV、PCV2和PCV3的临床诊断提供准确和可靠的检测结果。

本研究采用建立的三重PCR方法，对2015年-2019年河南、河北和山西等地部分猪场患有母猪繁殖障碍或/和呼吸系统疾病的74份临床样品进行检测，PRV检出率为29.73%，且2015、2016、2017、2018和2019年分别为30.00%、35.71%、28.57%、30.00%和25.00%，高于孙颖等[10]对2018年我国28个省、市、自治区规模化猪场各年龄段疑似猪伪狂犬病发病猪的1 328份组织样品的PRV检出率(6.93%)，这可能因为试验的样品量小，或者不同的试验组所使用的引物特异性不同而造成。PCV2和PCV3的检出率分别为71.62%和58.11%，与徐朋丽等[20]报道的PCV2和PCV3检出率相当。2015、2016、2017、2018和2019年，PCV2检出率分别为60.00%、57.14%、71.43%、75.00%和87.50%，PCV3检出率分别为50.00%、57.14%、50.00%、60.00%和68.75%，可见PCV2和PCV3于2018年后呈现明显增高的趋势。此外，PRV和PCV2同时感染的检出率是25.69%，PRV和PCV3同时感染的检出率是21.62%，PCV2和PCV3同时感染的检出率是44.59%，PRV、PCV2和PCV3同时感染的检出率是16.22%。表明PRV阳性率较高，PRV仍未达到根除，PCV2和PCV3的检出率依然较高，且PRV、PCV2和PCV3之间双重或三重混合感染也相当严重，提示应加强对PRV、PCV2和PCV3的临床诊断和监测。

随着我国养猪业的规模化发展，多种病原混合感染日益严重。PRV、PCV2和PCV3不仅能够引起猪呼吸系统疾病，而且都能够引起母猪繁殖障碍，危害严重，而临床上很难区分是由PRV、PCV2或/和PCV3感染所引起的，因此，本试验建立了一种特异、灵敏和准确的PRV、PCV2和PCV3三重PCR检测方法，可达到单重PCR的检测效果，而且极大地节约试验成本，更符合对疾病快速诊断的要求，降低了检测工作者的任务量，为我国的PRV、PCV2和PCV3的监测和防控提供技术保障。